ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 70, № 4, с. 418-425
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544.3
РАЗРАБОТКА И АДАПТАЦИЯ К УСЛОВИЯМ КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ МЕТОДИК ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНИЛКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
© 2015 г. В. В. Мороз*, Н. В. Белобородова*, 1, А. Ю. Бедова*, А. И. Ревельский*, **, М. Л. Гецина*, А. А. Осипов*, Ю. Н. Саршор*, А. А. Бучинская**, А. Ю. Оленин*, **, ***
*Научно-исследовательский институт общей реаниматологии им. В.А. Неговского Российской академии медицинских наук 107031 Москва, ул. Петровка, 25, стр. 2 1Е-таИ: nvbeloborodova@yandex.ru **Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет
119992 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3 ***Институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского Российской академии наук
119991 Москва, ул. Косыгина, 19 Поступила в редакцию 08.02.2014 г., после доработки 17.04.2014 г.
Разработана методика определения фенилкарбоновых кислот (бензойная, и-гидроксифенилмолоч-ная, и-гидроксифенилуксусная, фенилмолочная, 3-фенилпропановая и фенилуксусная) в сыворотке крови методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором (ПИД). Количественные характеристики анализа, полученные с использованием ПИД и масс-спектрального детекторов, находятся в одном диапазоне и имеют общие тенденции изменения для разных групп образцов. Показано, что воспроизводимость результатов повышается при введении в процедуру пробоподготовки операции высаливания. Проведена оценка правильности результатов методом введено—найдено. Показана возможность использования широко используемого ПИД для количественного определения фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови в повседневной клинической практике.
Ключевые слова: фенилкарбоновые кислоты, капиллярная газожидкостная хроматография, пламенно-ионизационный детектор, силилирование, сыворотка крови, клинический анализ.
Б01: 10.7868/$004445021504012Х
Процессы, протекающие на системном уровне в живом организме, имеют собственный "химический отпечаток". Поиск и достоверное определение содержания маркеров того или иного заболевания в настоящее время — одно из наиболее интенсивно развивающихся направлений клинической диагностики. Маркерами могут быть не только специфические белки, но и низкомолекулярные соединения. Развитие исследований в этой области привело к формированию новой дисциплины, названной "метаболомика" [1], внедрению в клиническую диагностику ряда связанных с ней новых терминов, например, "низкомолекулярный метаболический профиль" [2].
Среди низкомолекулярных метаболитов особую группу представляют фенилсодержащие кар-боновые кислоты. Они широко распространены в природе, довольно часто проявляют биологическую активность. В медицине наибольший инте-
рес к этим соединениям проявляют специалисты в области питания, гастроэнтерологии, онкологии, исследователи проблемы долголетия и качества жизни. Ранее в сыворотке крови человека нами изучен метаболический профиль фенилкарбоновых кислот (ФКК) и показано, что он коррелирует с клиническим состоянием пациентов [2—4]. В дальнейшем при культивировании in vitro бактерий микробиома человека выявлены низкомолекулярные фенилсодержащие продукты метаболизма, идентичные обнаруженным ранее в сыворотке крови человека, что может указывать на их преимущественно микробное происхождение в биологических средах макроорганизма [5, 6]. Происхождение такого рода метаболитов продолжает изучаться, причем в микробиологических исследованиях на чистых культурах условно-патогенных и индигенных бактерий динамика содержания ФКК асоциируется с микробным метаболизмом [6—9]. В то же время в международной
базе данных Human Metabolom Date Base (HMDB), содержащей информацию по 7900 метаболитам (HMDB) [10, 11], те же ФКК относят к продуктам человеческого метаболизма. В литературе чаще встречаются представления об алиментарном происхождении фенольных метаболитов в организме человека [12, 13], причем основным источником низкомолекулярных фенольных соединений считаются полифенолы растительного происхождения, входящие в состав чая, кофе, вина, фруктов, шоколада и т.п. [12—17]. Деградация полифенолов происходит в пищеварительном тракте с участием кишечной микрофлоры и приводит к образованию ФКК [12—18]. Наряду с полифенолами среди других предшественников фе-нольных метаболитов называют ароматические аминокислоты, реже — некоторые лекарственные препараты, стероиды, пищевые красители и др. В ряде работ утверждается, что ФКК участвуют в патогенезе как инфекционных, так и неинфекционных [8, 9, 19] заболеваний человека, а общебиологическая роль микробных метаболитов состоит в обеспечении динамического равновесия между микробиотой и организмом хозяина, т.е. в поддержании гомеостаза [20, 21].
В результате исследований последних лет с применением газовой хромато-масс-спектромет-рии определены уровни концентраций ФКК сыворотки крови у здоровых людей, а также у больных с различными заболеваниями. Показано, что высокий уровень ФКК коррелирует с тяжестью клинических проявлений и летальностью. В ходе исследований выявлены клинически значимые ФКК, которые потенциально могут быть использованы для диагностики, мониторинга и оценки эффективности лечебных мероприятий. Например, при сепсисе, который в последние годы вышел на первое место в структуре летальности среди реанимационных больных [22, 23], показано многократное увеличение уровня таких феноль-ных метаболитов, как фенилмолочная кислота, п-гидроксифенилмолочная кислота, п-гидрок-сифенилуксусная кислота по сравнению с фоновыми концентрациями. На основании этих данных предложено использовать ФКК в качестве биомаркеров сепсиса [3, 4, 7, 24]. В диагностике ряда заболеваний и состояний в перспективе могут использоваться другие ароматические соединения, такие как бензойная кислота, 3-фенил-пропановая кислота, фенилуксусная кислота. Так, на основе измерения общего уровня ФКК разработан и предложен для внедрения в практику способ оценки уровня интоксикации [24].
Имеются серьезные основания для изучения не только диагностической значимости, но и биологической роли ФКК, присутствующих в крови здорового и больного человека. Ранее показаны антиокислительные и противовоспалительные свойства некоторых ФКК [25], сообщается о вли-
янии фенольных соединений микробного происхождения на функции клеток эпителия толстой кишки человека в качестве антиканцерогенных агентов [26]. Фенольные метаболиты могут участвовать в механизмах критических состояний, оказывать влияние на функцию сигнальных молекул при развитии синдрома системного воспалительного ответа, полиорганной недостаточности и др. Все это свидетельствует об актуальности и востребованности методик определения ФКК, о необходимости их адаптации к условиям клинических лабораторий.
Традиционным методом количественного определения ФКК в биологических жидкостях является газовая хроматография в сочетании с масс-спек-трометрией. Данный метод характеризуется высокими чувствительностью, селективностью, достаточно низкой нижней границей определяемых содержаний вещества, однако он требует наличия дорогостоящего оборудования, высококвалифицированного персонала, что сдерживает его использование для решения клинических задач. Адаптация к условиям клинической лаборатории является одной из наиболее актуальных задач практического внедрения современных методик в практику. Один из путей решения — газохрома-тографическое определение целевых веществ на обычном газовом хроматографе, т.е. использование пламенно-ионизационного детектора вместо масс-спектрального (МСД).
Цель данной работы — разработка и адаптация к условиям клиники методик определения ФКК в сыворотке крови людей методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты. Использовали следующие реагенты: вода для инъекций (ОАО "Новосибхимфарм"); метанол (Fluka); (^О-бистриметилсил)три-фторацетамид (БСТФА) 99% + триметилхлорси-лан 1% (Fluka, Sigma-Aldrich); н-гексан (ч. д. а., ЗАО "ЭКОС-1"); эфир диэтиловый (ч. д. а., ХИММЕД); конц. H2SO4 (ос. ч., Сигма ТЕК), бензойная кислота, 99.5% (Fluka, Sigma-Aldrich); 2-гидрокси-3-(я-гидрокси)фенилпропановая кислота, >97% (для ВЭЖХ, Aldrich, Sigma-Aldrich); я-гидроксифенилуксусная кислота, 98% (Aldrich, Sigma-Aldrich); 2-гидрокси- 3-фенилпропановая кислота, 99% (Aldrich, Sigma-Aldrich); 3-фенил-пропановая кислота, 99% (Aldrich, Sigma-Aldrich); фенилуксусная кислота, 99% (Aldrich, Sigma-Ald-rich); 3,4-дигидроксибензойная кислота, 97% (Acros organics).
Аппаратура. Использовали следующее оборудование: весы аналитические OHAUS AV114C; вортекс персональный Biosan v-1 plus; центрифуга Elmi CM-6M; твердотельный термостат Biosan
TDB-120; газовый хроматограф Хроматэк-Кристалл 5000.2, оснащенный ПИД, газовый хроматограф Agilent Technologies 6890, оснащенный МСД Agilent Technologies 5973 в режиме полного сканирования.
Отбор проб и хранение сыворотки крови. Отбор крови производили в соответствии с ГОСТ Р 534202009 (кровь донорская и ее компоненты) и ГОСТ Р 53079.4-2008 (обеспечение качества клинических лабораторных исследований). Цельную кровь не позднее 20 мин после отбора центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин, отделяли сыворотку от эритроцитарной массы, замораживали и хранили при —20°C. Непосредственно перед анализом необходимый объем замороженной сыворотки нагревали до комнатной температуры, неиспользованный объем сыворотки повторно не замораживали.
Приготовление образцов для газохроматографи-ческого определения. В стеклянную пробирку емк. 10 мл помещали 800 мкл воды для инъекций, 200 мкл сыворотки крови, 10 мкл раствора в метаноле, содержащего 400 нг 3,4-дигидроксибензой-ной кислоты и при использовании метода добавок — метанольный раствор, содержащий известное количество ФКК. Далее к полученной массе добавляли 0.3—0.5 г твердого NaCl до образования насыщенного раствора и конц. H2SO4 до рН 2 (~20 мкл). После денатурации белка проводили экстракцию органических соединений диэтило-вым эфиром (3 х 1 мл). Полученный эфирный раствор медленно упаривали д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.