РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 4 с. 420-426
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ MYCOPLASMA HOMINIS И MYCOPLASMA PNEUMONIAE
© 2008 г. Н.Н. Шершнева, Л.Г. Горина
ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН,
Москва, Россия
Поступила: 26.03.08 г. Принята: 12.05.08 г.
Разработаны варианты иммуноферментной тест-системы для выявления антигенов M. pneumoniae и M. hominis в пробах сывороток крови больных с урогенитальной респираторной инфекцией. Чувствительность выявления растворимых антигенов микоплазм в модельных экспериментах колебалась в пределах от 3 до 4 нг/мл (по белку). Апробация тест-систем была проведена с использованием 165 проб сывороток крови, полученных от пациентов с подтвержденным диагнозом респираторной и урогенитальной инфекциями. При исследовании в ИФА антигены M. pneumoniae и M. hominis были обнаружены в 96 и 98% случаев соответственно. Специфичность определения микоплазменных антигенов была подтверждена результатами тестирования данных сывороток больных и выделенных из них циркулирующих иммунных комплексов в иммуноблотинге (включая те пробы, которые показали отрицательный результат при исследовании в ИФА) с использованием меченых пероксидазой хрена поликлональных антимикоплазменных антител к M. pneumoniae и M. hominis. Иммуноэлектрофоретическое исследование показало, что антигены M. pneumoniae были выявлены как в свободном состоянии, так и в составе ЦИК, специфическая реакция наблюдалась с белками, молекулярная масса которых находились в пределах от 30 до 170 кДа (30, 37, 45, 56, 58, 72, 90, 130 и 170(160) кДа). На иммуноэлектрофоре-граммах образцов крови и иммунных комплексов, выделенных из них, специфические антигены M. hominis находились в границах от 25 до 110 кДа (25, 55, 60, 58, 80, и 110 кДа). Это свидетельствует не только о специфичности определения микоплазм в ИФА, но и о том, что данным методом выявляется широкий антигенный спектр микоплазменных протеинов.
Ключевые слова: Антигены, M. pneumoniae, M. hominis, иммуноферментный анализ, имму-ноблотинг, респираторные и урогенитальные инфекции.
ВВЕДЕНИЕ
В последнее время внимание многих исследователей направлено на изучение микоплазм, являющихся причиной развития патологических процессов в органах мочеполовой и респираторной системы. Чаще всего из урогенитального тракта человека выделяют Ureaplasma urealyticuм. (U. urealyticuм), Mycoplasma hominis (М. hominis) и Mycoplasma genitalium. Основным возбудителем респираторного микоплазмоза, является Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae). Другие виды микоплазм, такие как
Адрес: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 8, НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. E-mail: lugor@bk.ru
M. hominis, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma fermentans, также могут вызывать пневмонии, фарингиты и другие заболевания верхних дыхательных путей человека [1, 2]. Урогенитальный микоплазмоз широко распространен среди разных групп населения. Наиболее часто он обнаруживается у лиц с повышенной половой активностью, а также у лиц, перенесших различные венерические заболевания. Распространенность M. hominis среди населения, по данным разных авторов, варьирует от 10 до 50% [3].
Исследования А.В. Цинзерлинга (2002) свидетельствуют, что внутриутробный микоплазмоз среди новорожденных, обусловленный M. hominis, составляет 34,4% среди всех внутриутробных инфекций. Нередки случаи выделения M. hominis из синовиальной жид-
кости, полученной от женщин, страдающих ревматоидным артритом [3].
Среди всех респираторных инфекций доля респираторного микоплазмоза, вызванного М. рneumoniaе, составляет 10 — 20%. Известны различные клинические формы этой инфекции: от легкого течения с симптоматикой на-зофарингита, трахеита, бронхита до тяжелых пневмоний, сопровождающихся различными респираторными и внереспираторными осложнениями [4]. Часто инфекция протекает бессимптомно, пневмонии микоплазменной природы составляют 10—16,3% случаев от общего числа пневмоний в различных возрастных группах. Основные трудности, с которыми сталкивается врач при ведении пациентов с микоплазменными инфекциями, чаще всего лежат в области диагностики. Для дифференциальной диагностики микоплазмозов человека используют как иммунологические, так и иммунохимические методы определения микоплазм и антител к ним (реакция аг-регат-гемагглютинации — РАГА, реакция пассивной гемагглютинации — РПГА, прямой и непрямой варианты реакции иммунофлюо-ресценции — РИФ, иммуноферментный анализ — ИФА) [1]. В последние годы активно разрабатываются и используются молекуляр-но-биологические тесты, одним из которых является метод амплификации ДНК, или по-лимеразная цепная реакция (ПЦР) [1].
Иммуноферментный анализ относится к экспресс-методам, обладающим высокой чувствительностью, его успешное применение обусловливается и выпуском различными фирмами диагностических тест-систем, но, в основном, диагностические препараты предназначены для выявления специфических антител, но не антигенов микоплазм. Широкое распространение урогенитальных и респираторных микоплазмозов среди населения, их ощутимое влияние на демографическую ситуацию в стране, частая бессимптомная форма носительства, служат основанием для разработки эффективных методов диагностики данных инфекций. Выявление только мико-плазменных антител недостаточно для правильной постановки диагноза при ведении пациентов с данными группами заболеваний. Учитывая, что на сегодняшний день в России нет зарегистрированных иммунофермент-ных тест-систем для выявления антигенов ми-коплазм, целью нашего исследования явилось создание подобных диагностических методов с использованием поликлональных антител к антигенам М. hominis и М. pneumoniae.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали Mycoрlasma pneumoniae (FH), Mycoрlasma hominis (H-34), Ureaplasma urealyticum (8 серотип), культуры которых выращивали на жидкой среде согласно методике, предложенной ранее [1]. Антисыворотки к антигенам микоплазм получали иммунизацией кроликов фракциями цито-плазматических мембран клеток микоплазм по схеме, разработанной в лаборатории ми-коплазм и L-форм бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН [5]. В качестве антигенов были использованы как целые клетки M. hominis и M. pneumoniae, так и биополимеры цитоплазматических мембран и цитоплаз-матическая фракция клеток микоплазм [6, 7].
Коньюгаты антител с пероксидазой хрена (КГ-ПХ) готовили методом перйодатного окисления карбогидратных групп пероксида-зы по Nakane Р.К. и Kawаoi А. (1974), используя гамма-глобулиновые фракции, выделенные сульфатом аммония из иммунной сыворотки кролика против антигенов М. hominis и М. рneumoniae [8, 9]. Субстратной смесью служил раствор тетраметилбензидина. Для проверки специфичности результатов, полученных в ИФА, использовали нормальную кроличью сыворотку и антигены других видов микоплазм. О результатах реакции судили по интенсивности окрашивании субстрата после инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут. Учёт результатов проводили инструментально путем измерения показателя экстинкции при 450 нм на мульти-скане «Sanofi Diagnostics Pasteur PR 2100» (США).
Для выявления антигенов М. hominis и М. рneumoniae в сыворотках крови больных наряду с ИФА также использовали РАГА. Определение иммуноглобулинов классов М и G в пробах сыворотки крови проводили с помощью иммуноферментных диагностических тест-систем «Микопневмоскрин», «Микого-москрин» и «ИФА-Мико-пневмо-IgM» производства ЗАО «Ниармедик Плюс» и ЗАО «ЭКОлаб» (Россия). Диагностический титр для антител IgM и IgG составил 1:800, 1:200 соответственно. Иммуноэлектрофоретическую характеристику антигенов микоплазм в сыворотках крови и в циркулирующих иммунных комплексах, выделенных по Digeon et al. (1977) [10], проводили с помощью «Вестерн-блот» анализа, а также варианта иммунобло-тинга с использованием поликлональных ан-тимикоплазменных антител, меченых ПХ [8,
10, 11, 12]. Электрофорез в полиакриламид-ном геле смеси биологических макромолекул антигенов М. pneumoniae и М. hominis осуществляли в присутствии додецилсульфата натрия. Электрофоретический перенос проводили согласно методике Towbin H., Gordon J. (1979), модифицированной Тсанг В.К.В. с соавторами (1984) [8, 12].
98 образцов сывороток крови от пациентов с диагнозами ОРВИ, бронхит и бронхиальная астма были получены из пульмонологического отделения ММА им. И.М. Сеченова. 67 сывороток от мужчин в возрасте от 22 до 54 лет с подозрением на урогенитальный микоплаз-моз и имеющих в анамнезе диагноз острого и хронического уретрита были получены из медико-санитарной части Федерального Управления медико-биологических и экстремальных проблем при МЗ России. В качестве контроля использовали образцы донорских сывороток (n = 100), полученных на станции переливания крови г. Орехово-Зуево.
Концентрацию белка в растворах иммуноглобулинов и пробах, содержащих растворимые фракции клеток микоплазм, определяли спектрофотометрически при оптической плотности (ОП) 280 нм. Постановку ИФА осуществляли на микротитровальных полистеро-ловых планшетах фирмы «Costar». Статистическую обработку проводили по формулам, рекомендованным Ашмариным И.П. и Воробьевым А.А.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Оптимальную сенсибилизирующую дозу антимикоплазменных антител определяли, исходя из их концентрации, рН комплексиру-ющего буфера, длительности и температуры инкубации антител на носителе. Установлено, что при рН = 9,6 0,2М карбонат-бикарбонат-ного буфера обеспечивается стабильная адсорбция поликлональных антител к M. hominis и М. pneumoniae в концентрации 10 мкг/мл на поверхности планшет. Оптимальное время фиксации — 17 часов при 4 °С. Для исключения появления ложноположительных реакций за счет видового гетероперекреста имму-носорбенты с иммобилизованными антителами были предварительно проинкубированы в течение 40 минут с блокирующим раствором, содержащим 1% BSA и 0,5% казеина.
В модельном эксперименте для реакции с адсорбированными на поверхности пластика специфическими антителами использовали
фракции цитоплазматических мембран и центрифугаты ультразвуковых дезинтегра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.