УДК 612.017.1:616.9
РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К СОЗДАНИЮ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ АНТИГЕННОЙ АКТИВНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОСАХАРИДНЫХ ЛИГАНДОВ, РОДСТВЕННЫХ ФРАГМЕНТАМ ЦЕПИ КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА Streptococcus pneumoniae ТИПА 14
© 2013 г. Е.А. Курбатова1*, Д.С. Воробьев1, И.Б. Семенова1, Е.В. Сухова2, Д.В. Яшунский2,3, Ю.Е. Цветков2, Н.Э. Нифантьев2
1 НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, 105064 Москва, Малый Казенный пер., 5а; факс: (495)917-4900, электронная почта: kurbatova6162@yandex.ru
2 Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, 119991 Москва, Ленинский просп., 47; факс: (499)135-8784,
электронная почта: nen@ioc.ac.ru
3 НИИ биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН,
119121 Москва, ул. Погодинская, 10, стр. 8
Поступила в редакцию 22.12.12 После доработки 26.01.13
Получен конъюгат синтетического гексасахаридного фрагмента капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae типа 14 с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Показано, что по своей антигенной активности и специфичности этот конъюгат сопоставим с природными антигенами S. pneumoniae типа 14. Полученные данные свидетельствуют о том, что полученный синтетический конъюгат может быть использован в качестве покрывающего антигена в экспериментальной тест-системе (на основе иммуноферментного анализа) для оценки антигенной активности синтетических олигосахаридных лигандов, тестирования опытных образцов природных капсульных полисахаридов и иммунных сывороток.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Streptococcus pneumoniae типа 14, капсульный полисахарид, синтетический олигоса-харидный фрагмент, конъюгат олигосахарида с БСА, антигенная активность.
Бактерии, относящиеся к виду Streptococcus pneumoniae, являются причиной тяжелых воспалительных заболеваний респираторного тракта, менингита, отита, бактериемии и др. [1—3], нередко заканчивающихся летально [4, 5]. У большинства штаммов пневмококков имеется поли-сахаридная капсула, являющаяся важным фактором вирулентности этого микроорганизма [6, 7]. Исходя из антигенных свойств полисахарид-ной капсулы, выделяют 46 серогрупп S. pneumoniae, среди которых определяют более 90 серо-типов [8—10]. Спектр превалирующих типов капсулы варьирует в зависимости от возраста, временного фактора и географического региона, хотя наиболее часто встречающиеся сероти-пы идентифицированы повсеместно. При этом лишь около 20 серотипов S. pneumoniae ассоци-
* Адресат для корреспонденции.
ированы с более чем 80% инвазивных пневмоний [11].
Одним из наиболее распространенных серо-типов S. pneumoniae на протяжении последних двух десятилетий является S. pneumoniae типа 14 [11—16], природный капсульный полисахарид которого входит во все коммерческие пневмококковые вакцины.
Капсульный полисахарид S. pneumoniae типа 14 состоит из тетрасахаридных повторяющихся звеньев [17], являющихся его минимальной им-мунологически активной структурной составляющей. Структура капсульного полисахарида S. pneumoniae типа 14 хорошо изучена, что открывает возможность химического синтеза его олигоса-харидных фрагментов различной длины. Известно, что конъюгаты синтетических олигосаха-ридных фрагментов капсульного полисахарида S. pneumoniae типа 14 с белком-носителем спо-
собны индуцировать образование IgG-антител, специфичных к нативному капсульному полисахариду того же типа [18]. Подобные синтетические иммунологически активные конъюгаты имеют преимущество перед природными кап-сульными полисахаридами, которые часто содержат трудноотделимые примеси белка, тейхо-евых кислот (С-полисахарид), нуклеиновых кислот и других антигенов микробной клетки.
В рамках разработки подходов к созданию конъюгированных пневмококковых вакцин на основе синтетических олигосахаридных лиган-дов было необходимо разработать метод для оценки антигенной активности и этих лигандов. Целью настоящего исследования являлось изучение возможности создания экспериментальной тест-системы на основе иммуноферментно-го анализа с использованием в качестве покрывающего антигена синтетического гексасахари-да, родственного фрагменту цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae типа 14.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы микроорганизмов. Штаммы S. pneumoniae типов 14, 19А и 19F из Коллекции ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН использовали для получения диагностических антимикробных сывороток путем многократной иммунизации мышей возрастающими дозами живой культуры.
Получение природных антигенных препаратов из S. pneumoniae типа 14. Микробные клетки культивировали в сердечно-мозговом бульоне в течение 24 ч при 37°, клетки отделяли центрифугированием, полисахаридно-белковый комплекс выделяли из супернатанта осаждением ацетоном. Полученный препарат использовался в качестве препарата сравнения.
Препарат из антигенов микробной клетки S. pneumoniae типа 14 получали из высушенных ацетоном микробных клеток с последующей трехкратной водной экстракцией [19]. Препарат содержал 5% углеводов, 53,5% белка и 28% нуклеиновых кислот и использовался в качестве ре-ференс-препарата.
Вакцина пневмококковая поливалентная полисахаридная «Пневмо 23» («Sanofi Pasteur», Франция). Одна доза вакцины (0,5 мл) содержит очищенные природные капсульные полисахариды 23-х типов S. pneumoniae, в т.ч. тип 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F (по 25 мкг каждого в фенольном буферном растворе, содержащем фенол, NaCl, Na2HPO4 ■ 2H2O, NaH2PO4 ■ 2H2O, воду для инъекций до 0,5 мл). Вакцина исполь-
зовалась для сравнения антигеннои активности исследуемых препаратов.
Получение синтетического капсульного полисахарида S. pneumoniae типа 14 описано ранее [20, 21].
Синтез гексасахаридного фрагмента капсульного полисахарида S. pneumoniae типа 14 (1) будет описан отдельно.
Получение конъюгата гексасахарида 1 с БСА (4) скваратным методом [22, 23] представлено на рис. 1. Диэтилскварат 2 (1,6 мкл; 11 мкмоль) и Et3N (1,5 мкл) прибавляли к раствору гексасахарида 1 (9,3 мг; 8,7 мкмоль) в 50%-ном водном этаноле (800 мкл), смесь выдерживали в течение 4 ч при комнатноИ температуре и затем концентрировали. Остаток растворяли в воде и наносили на патрон Sep-Pak C-18 («Waters», США). Патрон промывали водоИ (10 мл), затем продукт элюировали водным MeOH порциями по 2 мл, повышая концентрацию метанола от 5 до 20%. Концентрацией элюента и последующей лио-филизацией из воды получили соединение 3 (9 мг, 95%) в виде белого аморфного порошка. Масс-спектр высокого разрешения: найдено m/z 1221.4015 [M + Na]+; рассчитано для C46H74N2NaO34 m/z 1221.3982.
Соединение 3 (9 мг; 7,5 мкмоль) и БСА (25 мг; 0,380 мкмоль) в 190 мкл буферного раствора (350 мМ КНСО3 и 70 мМ Na2B4O7 ■ 10 H2O, рН 9) выдерживали в течение 48 ч при комнатной температуре. Полученную смесь подвергали гель-хроматографии на колонке Sephadex G-15 (350 х 25 мм) в воде, после лиофилизации получили конъюгат 4 (34 мг, 98%) в виде белого аморфного порошка. В масс-спектре MALDI-TOF присутствовал широкий пик с максимумом при m/z 84 342, что соответствует включению в конъюгат в среднем 18-гексасахаридных остатков.
Химический состав препаратов. Содержание белка в препаратах определяли по методу Лоури при 750 нм [24], углеводов — по методу Дюбуа при 490 нм [25], нуклеиновых кислот — спектро-фотометрически при 260 нм.
Получение гипериммунных мышиных сывороток S. pneumoniae типа 14. Для определения специфической активности синтетических и природных препаратов капсульного полисахарида S. pneumoniae типа 14 диагностические гипериммунные сыворотки получали к микробным клеткам S. pneumoniae типов 14, 19А и 19F. Последние две сыворотки предполагалось использовать в качестве положительного контроля на наличие возможных перекрестных реакций со S. pneumoniae типа 14. Выбор иммунизирующей дозы живой культуры пневмококка производили в предварительных опытах по заражению мышей. Для этого использовали не менее пяти
_ 18
4
Рис. 1. Получение гликоконъюгата 4
заражающих доз микробной культуры. Для первой иммунизации использовали дозу 106 микробных клеток, не вызывающую гибели животных при внутрибрюшинном введении. Дальнейшую иммунизацию проводили десятикратно возрастающими дозами живой микробной культуры с интервалом две недели. Сыворотку крови получали через две недели после последней иммунизации.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) проводили для определения титра антител к повторяющемуся гексасахаридному фрагменту цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae типа 14. На плоскодонных полистироловых планшетах ВНИИ «Медполимер» сорбировали 0,2 мкг в расчете на лунку синтетического гликоконъюгата 4, растворенного в фосфатно-солевом буфере - ФСБ («Sigma», США) в течение 2 ч при 37°, затем оставляли на ночь при температуре 4°. После сорбции в лунки вносили
по 100 мкл в расчете на лунку исследуемой антимикробной сыворотки в двукратных разведениях, начиная с 1 : 100. Сыворотки разводили в ФСБ с 0,05%-ным Tween 20 («Panreac Syntesis», Испания) и инкубировали в термостате в течение 1 ч при 37°. После трехкратного отмывания сыворотки с помощью ФСБ с Tween 20 в объеме 200 мкл в расчете на лунку вносили рабочее разведение конъюгата в объеме 100 мкл. В качестве конъюгата использовали антитела диагностические против IgG (H + L) белой мыши, меченные пероксидазой, сухие (антивидовые), производства ООО «Медгамал», НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. После трехкратного отмывания сыворотки с помощью ФСБ с Tween 20 в объеме 200 мкл в расчете на лунку вносили проявляющий реагент — тетраметилбензидин (ТМБ) (ООО НПО «БиоТест Системы», Россия) в объеме 100 мкл в расчете на лунку. Через 20 мин реакцию останавливали 1 М раствором H2SO4 («Sigma»,
США). Оптическую плотность определяли на ИФА-ридере («iMark», Япония) при длине волны 450 нм. В качестве контроля использовали сыворотки интактных (неиммунизированных) мышей.
Конкурентный ИФА. Для определения антигенной активности гексасахарида 1 во все лунки, покрытые конъюгатом 4, прибавляли рабочее разведение сыворотки в ФСБ с Tween 20 в объеме 90 мкл в расчете на лунку. В первые два ряда к сыворотке прибавляли 10 мкл ФСБ,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.