научная статья по теме РАЗВИТИЕ ЭФФЕКТА СВИДЕТЕЛЯ В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В АДАПТИРУЮЩЕЙ ДОЗЕ Биология

Текст научной статьи на тему «РАЗВИТИЕ ЭФФЕКТА СВИДЕТЕЛЯ В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В АДАПТИРУЮЩЕЙ ДОЗЕ»

РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2010, том 50, № 1, с. 42-51

ЭФФЕКТ СВИДЕТЕЛЯ

УДК [57+61]::539.1.04:577.19:599.323.4:577.19

РАЗВИТИЕ ЭФФЕКТА СВИДЕТЕЛЯ В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В АДАПТИРУЮЩЕЙ ДОЗЕ

© 2010 г. А. В. Ермаков1, М. С. Конькова1, С. В. Костюк1, Т. Д. Смирнова1, Л. В. Каменева1, Р. В. Вейко1, И. Ю. Кубасова2, Л. Н. Любченко2, Н. Н. Вейко1*

Медико-генетический научный центр РАМН, Москва 2Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

После воздействия рентгеновского излучения (10 сГр) в мезенхимальных стволовых клетках человека (МСК) наблюдаются транспозиция (перемещение) локусов 1q12 гомологичных хромосом из примембранных областей вглубь ядра, их сближение и активация ядрышкообразующих районов хромосом — начальные этапы развития адаптивного ответа (АО). Перенос среды культивирования облученных МСК к интактным клеткам-свидетелям индуцировал в последних все три исследуемых реакции, что указывает на развитие эффекта свидетеля (ЭС). Ранее аналогичные результаты по индукции радиацией АО и ЭС были получены для О0-лимфоцитов человека. Совокупность полученных данных указывает на универсальность реакции транспозиции локусов гомологов хромосом, выявляемой при развитии АО в дифференцированных (лимфоциты) или недифференцированных (МСК) клетках человека, и на возможность развития радиационного ЭС в суспензионных и моно-слойных культурах клеток при переносе факторов стресс-сигнализации через инкубационную среду. Мы полагаем, что таковыми являются фрагменты внеклеточной геномной ДНК апоптотических клеток.

Мезенхимальные стволовые клетки человека, ядрышко, рентгеновское излучение, малые дозы, транспозиция локусов хромосом, адаптивный ответ, эффект свидетеля, апоптоз, TLR9/MyD88.

Во многих соматических тканях обнаружены клетки, существенно отличающиеся рядом физиологических особенностей от всех других клеток организма. Названы они стволовыми клетками (СК) и обладают особыми способностями к самообновлению (при клеточном делении одна или обе дочерние клетки сохраняют биологические свойства родительских клеток и таким образом поддерживают пул СК неизменным), диффе-ренцировке во множество типов клеток и потенциалом к неограниченной пролиферации. Комбинация этих отличительных свойств делает СК уникальными [1—3]. СК свойственна сложная иерархическая организация, впервые показанная для системы гемопоэза. Локализованные в своеобразных "нишах" среди стромальных клеток костного мозга, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) при дефиците зрелых клеток крови или иммунной системы начинают делиться. В результате из одной СК образуются две дочерние СК: одна — поддерживающая численную популяцию ГСК в нише, и другая — полипотентеная

*Адресат для корреспонденции: 115478 Москва, ул. Москворечье, 1, МНГЦ РАМН; тел.: (499) 612-81-93; факс: 324-0702; e-mail: ribgene@rambler.ru.

стволовая клетка (ПСК). Последняя при делении дает начало родоначальным миелоидной и лим-фоидной клеткам, а те — клеткам-предшественникам. Их потомки утрачивают способность к пролиферации и превращаются в полностью дифференцированные клетки крови и иммунной системы. Подобно ГСК костного мозга, всем другим СК организма так же свойственно образование иерархических цепей клеточных преобразований: стволовые клетки —»- коммитированные клетки —»- дифференцированные клетки.

Определенные места локализации и функционирования СК — ниши — существуют не только в костном мозгу [4, 5], но и в других органах: кишечнике, коже, головном мозгу, молочной железе и простате [6]. Внутри трехмерного пространства ниш существует определенная специальная организация СК [7, 8]. При этом они взаимодействуют с различными факторами (факторы роста, ци-токины, хемокины) в нише и вместе осуществляют регуляторные функции, контролируя самообновление и дифференцировку СК [9]. Поэтому ниша является не просто физическим местом (пространством) обитания СК, но также и их функциональным микроокружением [10]. В осуществлении контроля над функционированием СК — их

самообновлением, дифференцировкой и т.д. — имеют значение определенные сигнальные пути, играющие ключевую роль в раннем эмбриональном развитии и морфогенезе [11]. В этой внеклеточной сигнальной системе задействованы белки Wnt, Notch, Hedgehog (HH), BMP, Bmi-1 и некоторые другие [12, 13].

Среди СК костного мозга можно найти не только гемопоэтические, но и мезенхимальные СК. Впервые негемопоэтические мезенхимальные стволовые клетки (МСК) костного мозга были описаны Фриденштейном [14], который клонировал клетки, способные расти прикрепленными к культуральному пластику и дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты [15]. МСК — стромальные клетки, которые идентифицируются по экспрессии ряда молекул, включая CD105 (SH2) и СD73 (SH3/4), они негативны для гемопо-этических маркеров: CD34, CD45 и CD14 [16]. В экспериментах in vivo после внутриматочной трансплантации овцам МСК человека исследователи показали их сайт-специфическую дифферен-цировку в адипоциты, хондроциты, миоциты, кар-диомиоциты и др. типы клеток [17]. Предполагается, что потенциал дифференцировки МСК в клетки костной или жировой тканей контролируется (in vitro) с учетом конечного баланса между активированным рецептором PPARy и сигнальной системой Wnt [15].

Хотя считается, что клетки с характерными для МСК свойствами находятся практически во всех постнатальных тканях и органах [16], важной характеристикой МСК является их свойство мигрировать к участкам поврежденных тканей (например, почек, сердца или кожи) главным образом в результате локальной выработки воспалительных медиаторов, продуцируемых при поражении или восстановлении тканей организма. МСК, доставляемые через систему кровотока, обладают так же способностью внедряться в опухолевое микроокружение [18]. Причем поступление туда МСК может активироваться экспрессией воспалительных медиаторов, усиленной воздействием радиации (1-5 сГр) [19].

Установлено: жировая ткань может служить альтернативным и более доступным для исследований - или терапевтических целей - источником МСК с большим дифференцировочным потенциалом [20], хотя такие МСК и отличаются некоторыми своими уникальными характеристиками от МСК костного мозга, включая различия в профиле CD-маркеров и генной экспрессии. Поэтому мы сочли возможным сделать МСК жировой ткани объектом нашего исследования.

Ранее нами показано, что ионизирующее излучение в малых дозах индуцирует в 00-лимфо-цитах человека развитие адаптивного ответа (АО), сопровождающегося транспозицией локу-сов гомологичных хромосом в пространстве кле-

точного ядра и активацией ядрышкообразующих районов (ЯОР) хромосом; эти реакции передаются необлученным лимфоцитам по механизму эффекта свидетеля — ЭС [21]. Используя упомянутые параметры, мы исследовали влияние радиации (10 сГр) на другие клетки человека — МСК, применив с учетом их морфологических особенностей иной, разработанный в лаборатории, подход к анализу изображений. Исследование было дополнено оценкой уровня образования двуните-вых разрывов ДНК (у-Н2А.Х-фокусы) и апоптоза МСК. Полученные данные позволяют предполагать, что индуцируемые радиацией реакции, указывающие на формирование АО и развивающиеся в облученных МСК и необлученных МСК-свидетелях, опосредованы ДНК-сигнальным механизмом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Выделение и культивирование клеток. Мезен-химальные стволовые клетки были получены из жировой ткани операционного материала больной с аденокарциномой молочной железы (МЖ), доставленного из РОНЦ РАМН в течение часа после резекции опухоли. Образец был механически измельчен в среде ДМЕМ ("ПанЭко", Москва), содержавшей 250 мкг/мл гентамицина, 60 Ед/мл пенициллина и 60 Ед/мл стрептомицина ("ПанЭко"). Ферментную диссоциацию клеток провели в среде ДМЕМ, инкубируя препарат в присутствии 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки ("PAA", Австрия), 0.04% коллагеназы ("Sigma") и тех же антибиотиков в течение 16 ч при 37°C. Затем суспензию клеток центрифугировали (10 мин, 200 g), осадок перенесли в слайд-флаконы и клетки культивировали при 37°С в ба-зальной среде AmnioMax С-100 Basal Medium ("Gibco"), содержавшей AmnioMax Supplement C-100, 20 мкмоль/л HEPES ("Пан/Эко") и антибиотики. Сформировавшуюся субконфлюентную культуру МСК подвергали облучению.

Экспрессию мезенхимальными стволовыми клетками поверхностных белков исследовали методом проточной цитофлуориметрии. Клеточный монослой переводили в суспензию при помощи раствора Версена и промывали буферным раствором для окрашивания: фосфатно-солевым буфером (ФСБ), содержавшем 1% фетальной сыворотки и 0.1% азида натрия. Окрашивание клеток проводили в том же буферном растворе с использованием РЕ антител ("Becton Dickinson", США), меченных флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) в течение 1 ч при 4°С. В качестве негативного контроля использовали изотипические антитела, меченные соответствующими флуоресцентными красителями того же производителя. После инкубации клетки отмывали трижды в 1 мл буферного раствора для окрашивания и фиксировали 2%-

ным раствором параформальдегида. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре "FAC-SAria" ("Becton Dickinson"); полученные данные обрабатывали с использованием программы "WinMDI".

Облучение клеток. Субконфлюентную культуру МСК облучали при 20°С на установке импульсного рентгеновского излучения "АРИНА-2" ("Спектрофлеш", Россия). Амплитуда напряжения на рентгеновской трубке составляла ~160 кВ, максимум энергии в спектре излучения ~60 кэВ, мощность дозы 0.16 Гр/мин. После облучения клетки инкубировали в течение 3 ч при 37°С.

Эффект свидетеля. После воздействия радиации и 3-часовой инкубации среду в слайд-флаконах с интактными клетками заменяли средой экспонированных МСК и выдерживали в течение 3 ч при 37°С.

Приготовление клеточных препаратов. После облучения и инкубации клетки в слайд-флаконах промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ). Стекла извлекали и помещали в холодный фиксатор : метанол/ледяная уксусная кислота (3 : 1) на 10 мин. Повторив процедуру трижды стекла высушивали и пров

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком