ОНТОГЕНЕЗ, 2013, том 44, № 2, с. 126-135
РЕГУЛЯЦИЯ РАЗВИТИЯ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ^^^^^^ И УСТАНОВЛЕНИЕ СВЯЗЕЙ
УДК 591
РАЗВИТИЕ ХАБЕНУЛО-ИНТЕРПЕДУНКУЛЯРНОГО ТРАКТА У КРЫС
© 2013 г. А. А. Клепуков, И. Г. Макаренко
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ГСП-1, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: imakarenk@mail.ru Поступила в редакцию 03.09.11 г.
Окончательный вариант получен 16.11.11 г.
Исследование развития хабенулоинтерпедункулярного тракта (ХИТ) проводили на фиксированном мозгу плодов крыс на 21 день эмбрионального развития и неонатальных животных с 0 по 9 день пост-натального развития с помощью метода диффузии липофильного флуоресцентного карбоцианиново-го красителя Ди-Ай (1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат) по мембранам нейронов. Маркер наносили в ядра уздечки, интерпедункулярное ядро, а также на область ядер шва. Нейроны и волокна, содержащие Ди-Ай, выявляли на вибратомных срезах с помощью флуоресцентного и конфокального микроскопов. Было обнаружено, что реципрокные связи латерального ядра уздечки с ядрами шва формируются пренатально к Э21. Нейроны, иннервирующие ядра шва располагались в дорсо- и венрокаудальных отделах латерального ядра уздечки. Проекции медиального ядра уздечки на интерпедункулярное ядро обнаруживаются лишь постнатально с П2. Нейроны — источники данных проекций формируют внутри медиального ядра уздечки характерные скопления. Таким образом, настоящая работа впервые описывает гетерогенное формирование отдельных проекционных систем, входящих в состав ХИТ у крыс в процессе перинатального онтогенеза.
Ключевые слова: уздечка, средний мозг, ядра шва, интерпедункулярное ядро, хабенулоинтерпедун-кулярный тракт, аксональные связи, карбоцианиновый краситель Ди-Ай, онтогенез, крысы.
DOI: 10.7868/S0475145013020031
Уздечка (Habenula) это парная структура промежуточного мозга, локализованная в дорсальной части таламуса. Вместе с шишковидным телом уздечка образует эпиталамус (Paxinos, 2004; Савельев, Негашева, 2005). В соответствии с терминологией Паксиноса (Paxinos, Watson, 1998) и на основе сведений о цитоархитектонике уздечки в ее составе было выделено медиальное и латеральное ядра (Andres et al., 1999). В свою очередь медиальное ядро уздечки включает в себя пять субъядер, а латеральное ядро уздечки делится на медиальную и латеральную части, включающие в себя до пяти субъядер.
Уздечка является важным звеном переключения в составе дорзальной проводящей системы мозга, связывающим посредством двух компактных трактов — медуллярной полоски (МП) и ха-бенуло-интерпедункулярного тракта (ХИТ), лимбические структуры переднего мозга и ба-зальные ганглии со средним мозгом. Причем, если МП является строго афферентным путем к уздечке, то в состав ХИТ входят, как афферентные, так и эфферентные волокна. С помощью
метода прижизненного транспорта пероксидазы хрена, было установлено, что большинство нейронов медиального ядра уздечки посылает аксоны в интерпедункулярное ядро (ИПЯ) среднего мозга (Herkenham, Nauta, 1979). Было показано существование определенной топографической организации хабенулоинтерпедункулярных проекций: дорсальная часть медиального ядра уздечки дает эфферентные волокна, оканчивающиеся в вентральной части ИПЯ, латеральная часть медиального ядра уздечки иннервирует дорсальный регион ИПЯ (Contestabile, Flumer-felt, 1981; Sutherland, 1982). Несмотря на то, что основные проекции на ИПЯ происходят из медиального ядра уздечки (Herkenham, Nauta, 1977), существуют данные, указывающие на то, что и латеральное ядро уздечки так же посылает аксоны в ИПЯ. Возможность связи латерального ядра уздечки с ИПЯ была показана косвенным методом разрушения латерального ядра уздечки с последующим измерением уровня ацетилхо-линтрансферазы и ацетилхолинэстеразы в ИПЯ (McGeer et al., 1979). Изменения концентрации этих ферментов в ИПЯ свидетельствовали о сня-
тии влияния латерального ядра уздечки, которое было бы возможно только при наличии прямых связей между латеральным ядром уздечки и ИПЯ. В многочисленных работах было показано, что эфферентые волокна латерального ядра уздечки преимущественно идут в структуры ствола мозга в составе ХИТ, их главными целями являются ядра, содержащие моноаминэргиче-ские нейроны, такие как дофаминсодержащая вентральная тегментальная область (ВТО) и черная субстанция (Beckstead et al., 1979; Phillipson, Pycock, 1982), а также серотонинсодержащие дорсальное и медианное ядра шва (Herkenham, Nauta, 1977; Klemm, 2004).
ХИТ также содержит и афферентные волокна, идущие из дорсального и медианного ядер шва к ядрам уздечки (Pasquier et al., 1976; Kalen et al., 1989). Также было установлено, что некоторые нейроны в ВТО проецируются назад в латеральное ядро уздечки (Gruber et al., 2007).
Несмотря на большое количество работ о связях уздечки с ИПЯ и структурами ствола, картина развития проводящих систем уздечки отсутствует, тогда как исследование ранних постна-тальных этапов развития внутримозговых связей представляет большой интерес и может внести существенный вклад в представления о развитии нервной системы в целом.
Цель настоящей работы — подробное исследование формирования основного проводящего пути, связывающего уздечку со средним мозгом — ХИТ, в процессе раннего постнатального развития у крыс. В работе использован метод анте-роградной и ретроградной диффузии липофиль-ного карбоцианинового красителя 1,1'-диоктаде-цил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлората по липидному слою мембран нейронов (Vercelli et al., 2000) — один из немногих, позволяющих изучать внутримозговые связи у плодов и неонатальных животных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работа выполнена на крысах Вистар полученных из Научного центра Биомедицинских технологий Российской Академии Медицинских Наук (поселок Столбовая), содержавшихся в условиях вивария ИБР РАН с естественным освещением. Для получения датированной беременности самцов подсаживали на ночь в клетку к самкам. День обнаружения спермы во влагалище самки считали нулевым днем эмбрионального развития (Э0), а день рождения — нулевым днем постнатального развития (П0). Для исследования использовали животных на разных сроках развития Э21 (n4), П0 (n2), П2 (n3), П4 (n1),
П6 (n4), П9 (n1). Крысят перед перфузией наркотизировали введением внутрибрюшинно раствора нембутала в физиологическом растворе (0.9%-ный раствор хлористого натрия в дистиллированной воде) из расчета 4 мг на 100 г веса животного. Животных перфузировали через левый желудочек сердца сначала физиологическим раствором для удаления крови из кровеносных сосудов, а затем 4% раствором парафор-мальдегида в 0.1 М фосфатном буфере (ПФА), декапитировали, мозг извлекали из черепа и помещали в ПФА при комнатной температуре на 12—20 часов. Далее на фиксированный мозг наносили кристаллы липофильного карбоциани-нового красителя 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тет-раметилиндокарбоцианина перхлората (Ди-Ай, Dil "Molecular Probes" Inc., США). Поскольку, структуры мозга, на которые планировалось наносить маркер, располагаются в толще мозга близко к средней линии мозга, то в большинстве случаев мозг разрезали пополам сагиттально. Ди-Ай наносили в проколы на поверхности среза в области уздечки (разная глубина аппликации кристаллов позволяла метить избирательно медиальное ядро уздечки или оба ядра уздечки одновременно), ИПЯ и область ядер шва среднего мозга (рис. 1а, 1б). Мозг с маркером хранили в ПФА в темноте при комнатной температуре от 6 до 12 месяцев, в течение которых происходила диффузия липофильного маркера по ли-пидному слою мембран нейронов в ретроградном и антероградном направлениях от места нанесения. Наложения маркера на уздечку и интерпедункулярное ядро приводили к четкому мечению ХИТ, который был виден даже под лупой на всех использованных сроках развития. Дальнейшее исследование проводили на сериях вибратомных коронарных или сагиттальных срезов, толщиной 80—100 мкм, натянутых кисточкой на предметные стекла и заключенных в полимеризующуюся среду мовиол ("Calbio-chem", Германия). Препараты анализировали в фотомикроскопе Leica DM RXA2 (Германия) с системой фильтров для выявления оранжево-красной родаминовой флуоресценции, характерной для Ди-Ай. После оценки распределения кристаллов маркера в месте введения с использованием ультрафиолетового фильтра серии срезов мозга последовательно просматривали, описывая локализацию окрашенных Ди-Ай нервных волокон и нейронов. Фотосъемку препаратов проводили с помощью цифровой фотокамеры Olympus DP70 (Япония) и специальной компьютерной программы для съемки, поставляемой вместе с ней (DP controller и DP manager). Обработку и монтаж цифровых изоб-
Рис. 1. Распределение Ди-Ай в области его нанесения на уздечку (а) и на интерпедункулярное ядро (б) сагиттально разрезанного фиксированного мозга, а также на сагиттальном (в) и коронарном (г) вибратомных срезах при нанесении маркера на уздечку. МП — медуллярная полоска, МУ — медиальное ядро уздечки, ЛУ — латеральное ядро уздечки, У — уздечка, ХИТ (черная стрелка) — хабенулоинтерпедункулярный тракт, 3ж — полость третьего желудочка, белая стрелка — нанесение на уздечку, звездочка — нанесение на интерпедункулярное ядро. Масштаб а—б — 5 мм.
ражений для иллюстрации полученных результатов осуществляли при помощи компьютерной программы Photoshop 7.0 ("Adobe", США). Идентификацию отделов и ядер мозга проводили с использованием атласов развивающегося мозга (Altman, Bayer, 1986; Paxinos et al., 1991) и мозга взрослой крысы (Paxinos, Watson, 1998).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Распределение Ди-Ай в месте его нанесения
Исследование каждого мозга начиналось с анализа распространения маркера в области его нанесения. Степень диффузии Ди-Ай в местах нанесения кристаллов варьировала в зависимости от области мозга и возраста животного. Так, помещение кристаллов Ди-Ай в ядра уздечки приводило к распространению маркера по всему объему уздечки, но на пренатальных и ранних постнатальных стадиях (Э21 и П2) наблюдалась незначительная диффузия красителя в прилежащие к уздечке с вентральной стороны отделы та-ламуса (рис. 1в). Позже на П6 и П
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.