ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 4, с. 447-452
ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 612.82:591.3:591.1
РАЗВИТИЕ НОРАДРЕНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ МОЗГА КРЫС ПОСЛЕ ПРЕНАТАЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ КОРТИКОСТЕРОНОМ
© 2013 г. Т. С. Калинина, Н. Н. Дыгало
Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Лаврентьева, 10 E-mail: kalin@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 31.07.2012 г.
Исследованы воздействия кортикостерона в чувствительный к гормональной индукции период экспрессии гена тирозингидроксилазы (16—18-е сут эмбриогенеза крыс) на онтогенез пресинапти-ческих маркеров норадренергической системы. Отмечено, что индуцированные гормоном изменения содержания норадреналина и дофамина в коре и стволе головного мозга носили транзиторный характер и нивелировались во взрослом состоянии. В то же время гормон повышал активность тирозингидроксилазы в коре 7-16-суточных крысят, а также в коре и стволе головного мозга взрослых животных. Показано, что уровень глюкортикоидов — важный фактор формирования норадренерги-ческой системы мозга, способный вызывать в критические сроки онтогенеза длительные изменения ее функционирования в последующие периоды жизни.
DOI: 10.7868/S0002332913040048
Условия раннего онтогенеза проявляются в виде долговременных и даже перманентных изменений физиологических функций (Shishkina, Dygalo, 1994; Harris, Seckl, 2011) и поведения (Dygalo, Kalinina, 1996; Markham, Koenig, 2011). Эти воздействия могут быть обусловлены изменениями активности регуляторных нейромедиатор-ных систем. Стресс и его гормоны — глюкокорти-коиды, действующие в раннем онтогенезе, влияют на активность одной из таких систем — норадренергической в головном мозге перинатальных и взрослых животных (Дыгало и др., 1991a; Дыгало, Калинина, 1993; Dygalo, Kalinina, 1994, 1996; Kreider et al., 2005; Green et al., 2011). Очевидно, один из механизмов длительных воздействий — изменение экспрессии ключевых для функции нейрохимической системы генов в критические сроки ее формирования. Действительно, кратковременное снижение в раннем онтогенезе с использованием антисенстехнологии или РНК-интерференции экспрессии гена альфа2А-адренорецепторов, важного регулятора норадре-нергической нейротрансмиссии, вызывает нарушения функции этой нейрохимической системы, а также зависимого от нее поведения животных в последующие периоды жизни (Shishkina et al., 2004a, b; Dygalo et al., 2008). Вместе с тем не только специфические ген-направленные экспериментальные воздействия, но и более естественные факторы, такие как гормоны стресса, способны изменить экспрессию генов в формирующемся мозге. Так, недавно была обнаружена глюкокор-тикоидная индукция гена ключевого фермента
биосинтеза катехоламинов, в их числе и норадреналина (НА) — тирозингидроксилазы (ТГ), — в головном мозге плодов крыс (Kalinina et al., 2012). Этот факт совместно с цитированными выше данными позволяет предполагать изменение онтогенеза норадренергической системы головного мозга после пренатального воздействия глюко-кортикоидами. Цель работы — исследовать развитие пресинаптических маркеров нейрохимической системы: активность ТГ и уровень катехоламинов — дофамина (ДА) и НА — в стволе и коре мозга, содержащих соответственно перикарионы и терминали норадренергических нейронов, после воздействия кортикостероном в пренаталь-ный, чувствительный к глюкокортикоидам период формирования норадренергической системы головного мозга.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Крыс линии Вистар содержали в условиях свободного доступа к воде и корму в виварии ИЦиГ СО РАН и использовали в опытах согласно Правилам гуманного обращения с экспериментальными животными, утвержденным Комиссией по биоэтике ИЦиГ СО РАН в соответствии с Директивой Европейского Парламента и Совета ЕС 2010/63/Еи от 22 сентября 2010 г. и Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ Минздрава СССР № 755 от 12 августа 1977 г.).
День обнаружения спермы во влагалищном мазке самки, содержащейся с самцом, считали
Масса тела крыс (г) после воздействия кортикостероном на 16-е и 18-е сут внутриутробного развития
Возраст, сут Контроль Введение гормона ANOVA
2 6.34 ± 0.21 (15) 6.79 ± 0.21 (15) >0.1
7 14.8 ± 1.00 (10)* 13.7 ± 0.40 (10)* >0.1
16 33.6 ± 2.30 (12)* 32.8 ± 1.22 (10)* >0.1
21 43.4 ± 2.20 (8) * 47.9 ± 2.50 (10)* >0.1
35 59.43 ± 2.10 (15)* 60.1 ± 2.34 (15)* >0.1
70 165.0 ± 6.50 (15)* 161.5 ± 3.81 (15)* >0.1
* p < 0.05 по сравнению с предыдущим сроком развития.
первыми сутками беременности. Самкам подкожно вводили 25 мг/кг/2мл кортикостерона (СаМосИет, США) на 16-е и 18-е сут беременности. Контрольные животные получали растворитель (0.2%-ный раствор Tween-80 (Sigma, США) в дистиллированной воде) или оставались интакт-ными. День родов считали первыми сутками жизни крысят. Период вскармливания длился 21 сут. С этого возраста самцов и самок каждого помета содержали раздельно. Исследовали потомков обоего пола на 2, 7, 16 и 21-е сут жизни, а также 35- и 70-суточных самцов, которых за 3 сут до опыта рассаживали в индивидуальные клетки. Животные каждой возрастной группы каждого воздействия были представителями 3—4 пометов.
Головной мозг выделяли после быстрой дека-питации на холоду. У 2-суточных крысят мозг без мозжечка рассекали по плоскости, проходящей от эпифиза к перекресту зрительных нервов, на стволовую и фронтальную части. Стволовая часть включала в себя задний и средний мозг, а также гипоталамическую область промежуточного; фронтальная — конечный мозг и надгипота-ламическую область промежуточного. Начиная с 7-х сут жизни у животных выделяли ствол мозга, включающий в себя продолговатый мозг и область моста — весь блок ткани каудальнее задних бугров четверохолмия и ростральнее овального отверстия без мозжечка и фронтальную кору, которая включала в себя фронтальную половину верхней поверхности полушарий толщиной 1.5— 3.0 мм. Отделы мозга были выбраны на основании локализации перикарионов норадренергиче-ских нейронов (ствол мозга) и их терминалей (кора мозга).
Активность ТГ в гомогенатах ткани мозга определяли in vitro по скорости образования конечного продукта ферментативной реакции — L-ДОФА (Дыгало, 1987) и выражали в пМ/мг растворимого белка в 1 мин (Lowry et al., 1951). Содержание ДА и НА определяли флуориметриче-ски и выражали в нг/г массы образца ткани мозга, как описано ранее (Shishkina et al., 2001). Кроме того, для оценки возможного катаболического воздействия кортикостерона на развитие живот-
ных определяли массу их тела (с точностью 0.01 г), а также в гомогенатах образцов ткани ствола и коры мозга (в 2 М №С1 на 0.05 М фосфатном буфере, рН 7.4) определяли суммарное содержание белка (Lowry а1., 1951), включающее в себя как его мембранную, так и растворимую фракции.
Данные на рисунках и в таблице представлены в виде М ± т. Статистическую обработку результатов проводили двухфакторным (возраст, прена-тальное воздействие) дисперсионным анализом с последующим определением межгрупповых различий по LSD-критерию Фишера (пакет программ 81аЙ8Йса 6.0). Онтогенетические линейные корреляции между пресинаптическими маркерами норадренергической системы рассчитывали методом Пирсона.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Ни по одному из исследованных параметров между потомками интактных и получавших растворитель самок не было обнаружено достоверных различий, что позволило объединить их в контрольные группы для всех исследованных возрастных периодов.
В отличие от воздействия растворителя воздействие кортикостероном вызывало проявляющиеся в разные возрастные периоды изменения пресинаптических маркеров норадренергической системы, которые накладывались на нормальный ход их онтогенеза. Так, в стволе головного мозга, в котором локализованы клеточные тела норадре-нергических нейронов, активность ТГ прогрессивно увеличивалась до пятой недели после рождения (влияние возраста: Д5.69) = 20.64, р <0.001) (рис. 1а). Потомки самок, инъецированных кортикостероном, имели сниженную на 35-е сут развития и повышенную на 70-е сут жизни активность фермента (взаимодействие возраст-гормон: Д5.69) = 2.46,р < 0.05). Содержание ДА и НА возрастало до третьей недели после рождения в стволе мозга животных контрольной и подопытных групп (влияние возраста на содержание ДА и НА: Д5.76) = 42.82, р < 0.001 и
РАЗВИТИЕ НОРАДРЕНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ МОЗГА КРЫС
449
Д5.79) = 30.50, р <0.001 соответственно) (рис. 1б, в). При этом если уровень ДА после пре-натального введения кортикостерона был выше у однонедельных и ниже у 21-суточных крысят (взаимодействие возраст х гормон: Д5.69) = 2.34, р < 0.05), то уровень НА не отличался ни в один из исследованных сроков развития от уровня НА у контрольных животных (взаимодействие возраст-гормон: Д5.79) = 0.25,р > 0.1). Изменение гормонального баланса во время беременности не нарушало взаимосвязи между анализируемыми показателями в стволе головного мозга. Корреляции между активностью ТГ и уровнем НА были достоверными и у контрольных крыс (г = 0.95;р < 0.05), и у животных после гормонального воздействия (г = 0.81;р < 0.05), также как и корреляции между уровнями ДА и НА (контроль: г = 0.64, р < 0.05; гормон: г = 0.56, р < 0.05).
В коре мозга, содержавшей терминали норад-ренергических нейронов ствола, активность ТГ в первые две недели жизни снижалась до практически неопределяемых значений (рис. 2а). Прена-тальное воздействие кортикостероном способствовало сохранению некоторого уровня активности фермента в коре: и у 7-, и 16-суточных крысят подопытной группы активность ТГ в коре мозга была достоверно повышена (р < 0.05) по сравнению с таковой у контрольных животных. К 35-м сут постнатального развития активность ТГ в коре мозга вновь быстро возрастала как у крысят контрольной группы, так и у животных, подвергшихся пренатальныму гормональному воздействию, у которых было выявлено достоверное превышение активности фермента по сравнению с ее уровнем у контрольных животных на 70-е сут онтогенеза (влияние возраста: Д5.80) = 25.75, р <0.001; влияние гормона: Д1.80) = 12.77, р <0.001).
Воздействие гормоном в период внутриутробного разв
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.