УДК 611.81.013:611.811.013
РАЗВИТИЕ ПИРАМИДНЫХ НЕЙРОНОВ КОРЫ ПОЛУШАРИЙ КОНЕЧНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА ВО ВТОРОМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ
© 2010 г. Е. И. Краснощекова1, П. А. Зыкин1, Л. А. Ткаченко1, Т. Ю. Смолина2
1Санкт-Петербургский государственный университет 2Перинатальное отделение городского патологоанатомического бюро Санкт-Петербурга
Поступила в редакцию 05.08.2009 г.
Пренатальный онтогенез коры полушарий конечного мозга человека характеризуется особенностями, которые делают ее организацию уникальной. По этой причине результаты модельных экспериментов по развитию мозга животных не могут быть экстраполированы на морфогенез коры в течение среднего и позднего периодов гестации у человека. Настоящее исследование, посвященное изучению особенностей развития пирамидных нейронов коры полушарий конечного мозга человека, выполнено на мозге восьми плодов 16—26 гестационных недель. Иммуногистохимическое маркирование нейронов проведено с использованием антител к структурному белку микротрубочек МАР2. Начало экспрессии этого белка соответствует началу дендрогенеза, а приуроченность МАР2 к соме и дендритам позволяет определить морфотип нейронов и их локализацию в определенном слое коры. Показано, что иммунопозитивные пирамидные нейроны появляются в слое eV корковой пластинки уже на 18 неделе гестации. К 25 гестационной неделе в корковой пластинке выявляются две различные популяции пирамидных нейронов: в слое eV и позже развивающемся слое eIII. В соответствии с известным фактом повышенной уязвимости дифференцирующихся нейронов, по сравнению с нейробластами и зрелыми клетками, результаты исследования дают возможность предполагать, что критические периоды развития для популяций кортикофугальных и кортико-кортикальных пирамидных клеток приходятся на разные этапы второго триместра гестации.
Ключевые слова: неокортекс, пренатальный онтогенез, иммуногистохимия, структурный белок микротрубочек МАР2, критический период развития.
Решение одного из фундаментальных вопросов нейробиологии — ранней предуготовленности мозга человека к биосоциальным воздействиям, предполагает изучение механизмов нейрогенеза и патогенеза неокортекса в пренатальный период. Проблема формирования мозга в онтогенезе — одна из приоритетных в медицине и биологии. Большое число клинических наблюдений и экспериментальных исследований на животных свидетельствуют о том, что воздействия неблагоприятных факторов среды в определенные периоды пренатального формирования мозга и его функций (критические периоды:) оставляют длительный след, создают основу для развития многообразных нервно-психических изменений, проявляющихся после рождения по мере взросления особи [1]. Среди недоношенных новорожденных дефекты мозга составляют подавляющую часть органических поражений, что свидетельствует о влиянии патологических факторов на мозг в течение беременности и/или постнатально, когда условия морфогенеза, в связи с преждевременным рождением, становятся отличными от внутриутробных, сопутствующих развитию мозга при нормально протекающей беременности [2].
Эмбриональное развитие коры полушарий конечного мозга происходит сложно, в нем выделяют несколько этапов. Начальным этапом становления коры является процесс формирования препластин-ки или примордиального плексиформного слоя [3, 4]. На 7—8 постовуляционной неделе у человека ней-робласты корковой пластинки расщепляют препла-стинку на маргинальную зону и субпластинку. В дальнейшем маргинальная зона образует слой I дефинитивной коры, последовательные волны миграции нейробластов образуют закладку слоев корковой пластинки по принципу "изнутри-наружу", субпластинка в той или иной степени элиминируется и присутствует, главным образом, в развивающемся мозге млекопитающих [5, 6].
В наших ранее выполненных исследованиях были выявлены определенные закономерности развития корковой пластинки и субпластинки в височной и постцентральной областях коры мозга человека в течение второго — третьего триместров гестации. Для объективной оценки онтогенетических преобразований неокортекса был разработан количественный критерий дифференцировки субпластинки в его составе, а именно — положительно коррелирующие показатели снижения клеточной плотности
наружной каймы корковой пластинки (слоя eII) и верхней зоны субпластинки №„). Полученные результаты позволили выдвинуть предположение о том, что дифференцировка нейронов слоев V—VI, организующих кортикоспинальные, кортикотек-тальные, кортикобульбарные, кортикоталамиче-ские связи (далее в статье эфферентный комплекс коры), происходит в присутствии субпластинки и незначительно зависит от ее состояния. Слои II—IV, основная составляющая ассоциативного комплекса коры, нейроны которого организуют кортико-кор-тикальные (внутрикорковые, внутри- и межполу-шарные) связи, начинают дифференцироваться усиленным темпом только после начала элиминации нейронов субпластинки в конце второго триместра гестации [7].
Базовые типы корковых нейронов происходят из разных герминативных зон: проекционные пирамидные из вентрикулярной, субвентрикулярной паллиальной области, а часть интернейронов, кроме того, из ганглионарных бугорков субпаллиальной области [8]. В последние два десятилетия классификацию корковых нейронов успешно осуществляют с помощью молекулярных маркеров, которые позволяют не только выделять определенные морфотипы клеток, но и получать сведения об их функциональных особенностях. У грызунов выделены экспресси-онные факторы, которые определяют постмитоти-ческую и постмиграционную специализацию пирамидных нейронов. Так синтез Sox5 характерен для всей совокупности кортикофугальных нейронов, а Satb2 маркирует пирамидные клетки слоев II—IV, которые образуют кортико-кортикальные внутри- и межполушарные ассоциативные связи [9]. У мышей, ноль-мутантных по Satb2, пирамидные нейроны этих слоев посылают свои аксоны субкортикально через внутреннюю капсулу, то есть специализируются как кортикофугальные клетки [10]. У грызунов клетки, инициирующие кортико-корти-кальные связи, не имеют строгой приуроченности к верхнему этажу коры и в слое V образуют смешанную с кортикофугальными нейронами популяцию. Вместе с тем по синтезу отдельных транскрипционных факторов в этом морфологически едином слое можно выделить кортико-кортикальные пирамидные клетки, экспрессирующие Lmo4, и кортикоспинальные, экспрессирующие С/ш1 [11]. Таким образом, результаты молекулярно-биологических исследований свидетельствуют о том, что морфологически единая популяция пирамидных клеток, в соответствии с функциональной специализацией, неоднородна по экспрессии генов и, соответственно, по синтезируемым белкам, очередность постмитоти-ческой и постмиграционной дифференцировки этих нейронов также детерминирована [12].
Молекулярные механизмы, контролирующие этапы нейрогенеза коры в пренатальном периоде у человека, по понятным причинам изучить в полном объеме не представляется возможным. В то же время
знание последовательности созревания функционально специализированных нейронов очень важно для формирования представлений об очередности критических периодов развития и о механизмах патогенеза. В процессе нейрогенеза некоторые из белков синтезируются только нейронами (но не ней-робластами и глиальными клетками), в их числе — белок МАР2. Структурные белки, ассоциированные с микротрубочками, или MAP (microtubule associated proteins), относятся к фибриллярным белкам, которые обратимо связываются с микротрубочками, способствуя их полимеризации. Белок МАР2 обнаружен в нейронах, в то время как МАР4 встречается во многих иных клетках [13]. Синтез МАР2 сопутствует началу дендрогенеза и знаменует собой процесс включения клетки в нейронные сети. Ранняя экспрессия, а также приуроченность этого белка к соме и дендритам делает его уникальным маркером развивающихся нейронов [14].
Принимая во внимание важное значение структурных признаков, характеризующих последовательные этапы кортикогенеза, целью настоящей работы явилось иммуногистохимическое, с применением антител к МАР2, изучение особенностей развития пирамидных нейронов в составе ассоциативного (инициирующего кортико-кортикальные связи) и эфферентного (инициирующего кортикофугальные связи) комплексов коры полушарий конечного мозга человека в течение второго триместра гестации.
МЕТОДИКА
Материалом исследования явились фронтальные срезы левого и правого полушарий мозга восьми плодов человека обоих полов в возрасте 16— 26 недель гестации. При идентификации области исследования руководствовались цитоархитектони-ческими картами ГИ. Полякова для мозга плодов второго триместра гестации [3]. Исследовался мозг плодов, которые по заключению патологоанатома не имели неврологической патологии. Анатомическое строение коры полушарий каждого мозга, с целью идентификации борозд, извилин, границ областей, сопоставляли с имеющимися в литературе сведениями об этом для соответствующего гестаци-онного срока [15, 16].
Мозг фиксировали в 4% растворе параформаль-дегида на 0.1М фосфатном буфере, рН 7.4. Выделенные блоки коры заливали в парафин, полученные срезы, толщиной 12 мкм, окрашивали крезиловым фиолетовым по Нисслю, флуоресцентным красителем DAPI для клеточных ядер.
Иммуногистохимическую идентификацию нейронов проводили с использованием антител к структурному белку микротрубочек МАР2. Использовали первичные моноклональные антитела мыши производства "Sigma", клон HM2, вторичные антитела ло-
шади против иммуноглобулина мыши (легкая и тяжелая цепь), конъюгированные с флуоресцином (FITC) производства "Vfector Labs". Для снижения автофлуоресценции препаратов была проведена адаптация стандартного метода исследования, которая заключалась в предварительной обработке депа-рафинированных срезов 1% раствором хлорного железа. Далее препараты обрабатывали по стандартному протоколу и исследовали на конфокальном микроскопе Leica TCS SPE. МАР2 и DAPI обладают разными спектрами испускания и поглощения света, поэтому использование лазеров с разной длиной излучаемой волны позволило раздельно регистрировать эти флуорохромы: синюю окраску ядер DAPI и зеленые м^Р2-пози
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.