ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 44, № 2, с. 176-180
УДК 577.112:579.861.043:535.31
РЕАКТИВИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ Escherichia coli НА КЛЕТКИ, ПОДВЕРГНУТЫЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОМУ
ОБЛУЧЕНИЮ
© 2008 г. Л. И. Воробьёва, Е. Ю. Ходжаев, Г. М. Пономарёва
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119899
e-mail: nvvorobjeva@mail.ru Поступила в редакцию 13.06.2006 г.
Показано, что штаммы E.coli ("дикого" типа и мутантов АВ 1157 и К-12) в логарифмической фазе роста синтезировали экзометаболиты, проявляющие реактивирующую активность в отношении УФ-облученных клеток собственных продуцентов. Экзометаболит(ы) штамма К-12 представлен соединением белковой природы с молекулярной массой не выше 10 кДа. Реактивирующая активность экзометаболита находилась в обратной зависимости от выживаемости бактерий и в незначительной степени усиливалась под действием стрессовых факторов. Реактивирующий фактор (РФ) Luteococcus casei оказывал перекрестное реактивирующее и защитное действие на УФ-облученные клетки E.coli K-12. В результате активации РФ за счет УФ-облучения и нагревания его перекрестное защитное действие увеличивалось более, чем в 3 раза, а реактивирующий эффект не изменялся. Белковый экзометаболит E. coli не индуцировал перекрестного стрессового ответа у L. casei.
В последние годы накапливается большое число экспериментальных данных, демонстрирующих участие внеклеточных соединений бактерий в их адаптации к неблагоприятным условиям среды. Эти соединения могут проявлять прямое защитное действие [1], служить индукторами защитных механизмов (сенсоры, феромоны, алармоны) [2] или оказывать реактивирующее действие на клетки, инакти-вированные под действием факторов стресса[3].
Главным объектом в исследованиях межклеточных коммуникаций в условиях стрессов служат различные штаммы Escherichia coli и Salmonella typhi-murium, что, наряду с изучением социального поведения бактерий, имеет и важное практическое значение, поскольку способность энтеробактерий приобретать устойчивость к различным химическим и физическим стрессовым воздействиям, сохраняя жизнеспособность (в природных условиях, при процессинге пищи и кормов), может быть причиной заболеваний животных и людей.
Показано [4], что клетки E. coli выделяют в окружающую среду соединения, которые индуцируют устойчивость клеток к стрессовому фактору той же или иной природы. Так, кислото-, щелоче-, термо- и УФ-устойчивость у E.coli возникает при повышении температуры культивирования с 37 до 45-55°С; УФ-облучение индуцирует кислотоустой-чивость, а инкубация клеток в условиях слабой щелочности приводит к УФ-устойчивости [5].
Сенсорные экзометаболиты у E.coli представляют собой небольшие белки, которые образуются в ничтожных количествах [6] в культуре, подвергнутой стрессовому воздействию, где они были синте-
зированы, к интактной культуре или к культуре, не способной продуцировать аналогичные экзометаболиты, участвуя таким образом в перекрестном стрессовом ответе [7].
Под действием нагревания или короткого УФ-облучения сенсорный экзометаболит (СЭМ) активируется, превращаясь в индуктор стрессовых ответов (ИСО) [8].
Система СЭМ/ИСО уникальна в том отношении, что она индуцирует ответы устойчивости к стрессам до того, как организмы успевают контактировать со стрессором. Инкубация суспензии клеток E. coli с супернатантом, содержащим СЭМ, служит ранним предупреждением о возможной угрозе.
Предполагается, что у E. coli существуют различные ИСО и каждое из этих соединений ответственно за включение специфического стрессового ответа [5]. В природных условиях и в результате различного рода дезинфекционных процедур, вызывающих гибель большей части популяции, может происходить реактивация выживших, но неде-лящихся клеток. Реактивирующее действие белковых экзометаболитов было показано в отношении клеток Luteococcus casei, подвергнутых действию различных стрессовых факторов [3, 9], и Propionibacterium shermanii [10] при участии внеклеточных и внутриклеточных белковых компонентов соответственно.
Цель работы - изучение реактивирующего действия экзометаболитов E. coli и перекрестного реактивирующего действия внеклеточных факторов E. coli и L. casei.
Таблица 1. Реактивирующий эффект КЖ различных штаммов E. coli на клетки тех же культур, подвергнутых УФ-облучению
Условия эксперимента Среднее число клеток, х106 мл-1 Выживаемость, % Индекс деления
E. coli 52
Интактные клетки 61.2 ± 1.9 100 -
Облученные клетки, инкубированные:
с фосфатным буфером 0.0120 ± 0.0008 0.020 1.0
с КЖ 0.0520 ± 0.0039 0.090 4.3
E. coli AB 1157
Интактные клетки 82.0 ± 4.4 100 -
Облученные клетки, затем инкубированные:
с буфером 0.0306 ± 0.0018 0.038 1.0
с КЖ 0.0570 ± 0.0021 0.071 1.9
E. coli K-12
Интактные клетки 72.4 ± 5.6 100 -
Облученные клетки, затем инкубированные:
с буфером 0.0066 ± 0.0006 0.009 1.0
с КЖ 0.0276 ± 0.0009 0.038 4.2
МЕТОДИКА
Выращивание бактерий и получение источников реактивирующих факторов. Объектом для стрессовых воздействий служили клетки следующих штаммов E. coli : 52 ("дикий тип"), мутанты AB 1157 и К-12. Клетки 20-часовой культуры E. coli отделяли, промывали фосфатным буфером, разводили в 50 раз в питательном бульоне "Himedia" (Индия) и ставили на подращивание на 2 ч в аэробных условиях. Культуральную жидкость (КЖ) отделяли центрифугированием, клетки использовали в качестве тест-культуры.
Ранее было показано, что реактивирующая активность L. casei связана с белковым экзометаболи-том (РФ) КЖ и имеет молекулярную массу (м. м.) около 8 кДа [3]. Выделение РФ проводили, как описано ранее [3].
Определение защитной и реактивирующей активности. Для определения защитного и реактивирующего эффекта использовали микрометод [3]. В отличие от описанного ранее метода в одну чашку с агаризованной питательной средой вносили сразу 6 проб по 5 мкл суспензии вместо одной пробы объемом 100 мкл. Реактивирующий эффект оценивали путем сравнения числа колоний, выросших из клеток опытного и контрольного варианта. Выживаемость бактерий выражали в процентах по отношению к контролю. Индекс деления определяли как число клеток, образующих колонии после инкубирования с реактивирующим фактором к числу колоний, вырастающих из клеток без инкубации. В экспериментах по изучению реактивирующего и защитного эффектов суспензию клеток и КЖ (или РФ) смешивали в равных объемных долях.
Обработку РФ (1 мл) протеиназой К (0.05 мл суспензии, содержащей иммобилизованный на бусах фермент фирмы "Gelman", США) проводили при инкубации (1 ч, 37°С) в среде, содержащей 0.01 М трис, 0.005 М ЭДТА, рН 7.8.
Статистическая обработка. В таблицах представлены средние арифметические величины из 3 независимых экспериментов и их стандартные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Из данных, представленных в табл. 1, видно, что выживаемость клеток дикого штамма и штамма К-12, облученных УФ-лучами, в результате последующей инкубации с соответствующей КЖ увеличивалась более, чем в 4 раза. Реактивирующий эффект КЖ штамма АВ 1157 был в 2 раза ниже, поэтому в дальнейших экспериментах использовали штамм К-12.
Реактивирующее влияние КЖ штамма К-12 было тем выше, чем ниже выживаемость облученных клеток (табл. 2). Ранее [3, 9] такая же зависимость наблюдалась для РФ L. casei.
На белковую природу экзометаболита указывает исчезновение реактивирующей активности КЖ E.coli после ее обработки протеиназой К. При диализе с использованием мембран, пропускающих соединения с м.м. менее 10 кДа и нагревании при 75°С в течение 15 мин, реактивирующее действие КЖ не наблюдалось (табл. 3). Полученные данные показывают, что подобно внеклеточному ИСО штамма E. coli K-12 1829ColV [2], белковый экзометаболит E. coli К-12 представляет собой низкомолекулярное, но в отличие от вышеупомянутого, нетермо-стабильное соединение. Нагревание ИСО при
Таблица 2. Зависимость величины реактивирующего эффекта КЖ E. coli К-12 на клетки той же культуры, облученные УФ, от дозы облучения
Условия эксперимента Среднее число клеток, х106 мл-1 Выживаемость, % Индекс деления
Интактные клетки 91.0 ± 5.1 100 -
Облученные клетки (49 Дж/м2), инкубированные:
с буфером 0.0140 ± 0.0008 0.0150 1.0
с КЖ 0.0300 ± 0.0027 0.0330 2.2
Облученные клетки (57 Дж/м2), инкубированные:
с буфером 0.0054 ± 0.0002 0.0060 1.0
с КЖ 0.0156 ± 0.0007 0.0170 2.9
Облученные клетки (65 Дж/м2), инкубированные:
с буфером 0.0011 ± 0.0001 0.0012 1.0
с КЖ 0.0042 ± 0.0002 0.0047 3.9
Таблица 3. Реактивирующий эффект КЖ E. coli К-12, подвергнутой различным воздействиям
Условия эксперимента Среднее число клеток, х106 мл-1 Выживаемость, % Индекс деления
Интактные клетки 99.1 ± 1.5 100 -
Облученные клетки, инкубированные:
с буфером 0.015 ± 0.0005 0.015 1.0
с КЖ 0.036 ± 0.0021 0.036 2.4
с КЖ, предварительно обработанной протеиназой К 0.015 ± 0.0009 0.015 1.0
(0.1 мг/мл)
с КЖ, предварительно нагретой (75°С, 15мин) 0.021 ± 0.0012 0.021 1.4
с КЖ, предварительно диализованной 0.018 ± 0.0010 0.018 1.2
75 °С, 15 мин увеличивало его активность [2], а тот же режим термической обработки реактивирующего экзометаболита E. coli К-12 приводил к его инактивации.
В работах группы Р. Роубери было показано [5, 8, 11], что защитный эффект белкового экзометаболита E.coli 1829ColV проявляется только после его активации под действием нагревания или слабого УФ-облучения. При этом выживаемость клеток, подвергнутых облучению и нагреванию, увеличивалась в 10-50 раз. В соответствии с предположением автора [5], белковый экзометаболит E.coli 1829ColV может присутствовать в различных кон-формационных формах, которые под действием стрессорной активации расщепляются или модифицируются, в результате чего облегчается их диффузия в клетку или связывание с мембранными рецепторами. В наших исследованиях было показано, что КЖ штамма К-12 вообще не проявляет защитного действия, а ее реактивирующее действие лишь незначительно увеличивалось после активации по сравнению с исходной КЖ (табл. 4). Различие может быть связано со спецификой штаммов, образующих внеклеточные соединен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.