ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2014, том 40, № 2, с. 94-98
УДК 612.882,612.225
РЕАКЦИЯ РЕСПИРАТОРНОЙ СИСТЕМЫ НА ЛОКАЛЬНОЕ ОХЛАЖДЕНИЕ У ЛЮДЕЙ С ОДНОНУКЛЕОТИДНЫМ ПОЛИМОРФИЗМОМ rs11562975 ГЕНА ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО
ИОННОГО КАНАЛА TRPM8
© 2014 г. Т. В. Козырева1, Е. Я. Ткаченко1, Т. А. Потапова2, М. И. Воевода2, 3
Институт физиологии и фундаментальной медицины СО РАМН, Новосибирск 2Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск 3Институт терапии СО РАМН, Новосибирск E-mail: kozyreva@physiol.ru Поступила в редакцию 20.06.2012 г.
На основе геномных исследований среди лиц, относящихся к русской этнической группе, была выявлена группа с гетерозиготным генотипом, содержащим С-аллель в локусе однонуклеотидного полиморфизма rs11562975 (G ^ C), располагающегося в 6 экзоне гена, кодирующего термочувствительный ионный канал TRPM8. Для лиц этой группы характерен не только повышенный уровень ощущений к холоду, но также и гипометаболическая реакция на охлаждение кожи и на нетемпературную активацию холодочувствительного ионного канала TRPM8 ментолом — снижение газообмена, легочной вентиляции и коэффициента экстракции кислорода. Для субъектов, имеющих гомозиготный генотип GG, характерен более низкий уровень ощущений холода и адекватный ответ организма на охлаждение, с точки зрения терморегуляции (уменьшение теплоотдачи с дыханием и переход на жировой обмен).
Ключевые слова: однонуклеотидный полиморфизм гена ?грда8, локальное охлаждение, ментол, респираторные показатели, общий метаболизм.
DOI: 10.7868/S0131164614020106
В последние годы большое количество исследований механизмов холодовой чувствительности на клеточном и молекулярном уровне свидетельствуют о том, что термочувствительные ионные TRP каналы являются основными сенсорами изменения температуры. К настоящему времени идентифицировано два чувствительных к холоду ионных канала - TRPA1 и TRPM8. TRPM8 является ионным каналом, который активируется холодом в диапазоне физиологически значимых температур — 8-28°С. Ионный канал TRPM8 может активироваться также ментолом, ицилином и другими химическими агентами [1, 2]. TRPM8 экспрессируется на сенсорных нейронах задне-корешковых и тригеминального ганглиев [3], свободные нервные окончания которых и являются периферическими термочувствительными афферентами.
Ген, кодирующий белок термочувствительного катионного канала TRPM8, у человека локализован в районе 2q37.1 второй хромосомы [4]. Установлено наличие целого ряда однонуклеотидных полиморфизмов, расположенных в кодирующих и некодирующих участках гена (NCBI, Database
8МР). Однонуклеотидный полиморфизм г,у11562975 локализован в 6 экзоне гена ТЯРМ8 и обусловливает синонимичную замену нуклеоти-дов О ^ С (гуанина на цитозин), которая не меняет лейцин на другую аминокислоту в 250 позиции полипептида ТВРМ8. Ранее нами показано [5], что для людей с гетерозиготным генотипом ОС характерна повышенная чувствительность к холоду, по сравнению с людьми, имеющими гомозиготный генотип ОО. Однако роль данного однонук-леотидного полиморфизма (как и других полиморфизмов этого гена) в формировании эффек-торных реакций целого организма в ответ на холодовое воздействие остается не выясненной.
Хорошо известно, что центральные и периферические термочувствительные структуры являются важными сенсорными входами системы регуляции дыхания. Ранее [6, 7], в наших исследованиях была выявлена связь количества функционирующих холодовых терморецепторов на коже предплечья, лица и стопы с показателями дыхания человека. Это давало основание полагать, что изменение периферического температурного входа участвует в перестройке системы
РЕАКЦИЯ РЕСПИРАТОРНОЙ СИСТЕМЫ НА ЛОКАЛЬНОЕ ОХЛАЖДЕНИЕ
95
внешнего дыхания. Исходя из вышесказанного, мы попытались оценить связь между однонуклео-тидным полиморфизмом rs11562975 гена ионного канала TRPM8 и реакцией внешнего дыхания на охлаждение до и после активации термочувствительного ионного канала TRPM8 его агонистом ментолом.
МЕТОДИКА
Исследуемая выборка (21 человек) была сформирована из случайно отобранных жителей г. Новосибирска, относящихся к русской этнической группе. Обследованы практически здоровые добровольцы, мужчины и женщины (средний возраст 24.3 ± 1.15 лет), росто-весовой коэффициент которых составлял 2.8 ± 0.06. Обследуемые были предупреждены о цели исследования и предстоящих в ходе эксперимента воздействиях в соответствии с принципами Хельсинкской декларации.
Обследуемый в легкой одежде находился в термостатированной камере при температуре воздуха 22—23°С, сидя в кресле. Регистрировались следующие показатели: температура кожи на внутренней стороне предплечья, а также показатели внешнего дыхания (легочная вентиляция и газообмен).
С помощью термисторов TSD 202B измерительного комплекса фирмы BIOPAC непрерывно на протяжении всего эксперимента регистрировалась температура кожи на внутренней поверхности левого и правого предплечья.
Показатели внешнего дыхания (частота дыхания, минутный объем дыхания, коэффициент экстракции кислорода и выделение углекислого газа) регистрировались непрерывно во время всего обследования с помощью специальных блоков и программы системы Biopac MP-100. На основании зарегистрированных параметров рассчитывались дыхательный объем, общее потребление кислорода (мл/мин кг) и дыхательный коэффициент, как соотношение выделившегося углекислого газа к величине общего потребления кислорода.
Тестовое локальное охлаждение предплечья проводилось с помощью термода площадью 25 см2, температура термода 8—10°С. Продолжительность холодового воздействия — 5 минут. Тестовое охлаждение приводило к снижению температуры кожи на 5 ± 0.2°С.
Аппликация 1% раствора ментола — (-)Men-thol, (Sigma) в 50% этиловом спирте проводилась в течение 5 минут. Для этого 1 мл раствора равномерно наносился на фильтровальную бумагу соответствующего размера (25 см2), которая прикладывалась к коже правого предплечья.
Анализу подвергались исследуемые показатели: 1) в исходном состоянии, 2) во время тестово-
го охлаждения левого предплечья, 3) через 25 минут после аппликации ментола на правое предплечье, а также 4) во время последующего тестового охлаждения правого предплечья. Наши предшествующие исследования [8] показали, что через 25—30 минут после аппликации ментола наблюдается уменьшение количества функционирующих холодовых рецепторов на коже у всех испытуемых.
Забор крови для геномного анализа проводился натощак. Кровь брали из вены (5—10 мл в пробирки с антикоагулянтом — Vacuette c EDTA) и она хранилась при —20°С. Геномную ДНК из крови выделяли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [9]. Образцы геноти-пировали методом прямого автоматического се-квенирования. Для амплификации фрагмента использовали праймеры: прямой 5'-aggaggcataatgt-gattgaacc-3' и обратный 5'-tttggtagtgattgttgttgatgc-3'. Секвенирование продуктов амплификации проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism Genetic Analyzer 310 (Applied Biosystems, USA) с использованием набора BigDye Terminator cycle kit в Межинститутском центре секвенирования ДНК СО РАН (Новосибирск). Результаты секве-нирования анализировали с помощью программ DNA Star (Meg Align) и Chromas.
Статистическую обработку результатов проводили по стандартной методике с применением t-критерия Стьюдента. Данные представлены как M ± m.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Геномные исследования показали, что 5 человек (24%) имели гетерозиготный генотип по од-нонуклеотидному полиморфизму rs11562975 гена TRPM8, содержащий менее распространенный С-аллель (GC), остальные 16 человек (74%) были гомозиготы по более распространенному G-алле-лю (GG). Подобное распределение соответствует данным, полученным нами ранее в достаточно большой выборке [5, 10].
Как следует из полученных данных (таблица), температура кожи, легочная вентиляция и газообмен в исходном состоянии в обследованных группах людей не различались. Межгрупповых различий по изменению температуры кожи предплечья не обнаружено ни при охлаждении, ни при аппликации ментола.
Активация кожных терморецепторов охлаждением или ментолом выявила межгрупповые различия в реакции респираторной системы.
У лиц с гомозиготным генотипом GG, составляющих большинство обследованных, не наблюдалось изменений минутного объема дыхания, потребления кислорода, выделения углекислого
Влияние охлаждения и аппликации ментола на параметры внешнего дыхания и газообмен
Параметры
Исходные
Охлаждение
Аппликация ментола
Охлаждение после ментола
Обследованные лица с генотипом ОО
Температура кожи левого предплечья, °С 32.0 ± 0.11 27.1 ± 0.29
Температура кожи правого предплечья, °С 32.2 ± 0.09 32.1 ± 0.10 26.6 ± 0.31
Минутный объем дыхания, л/мин 7.6 ± 0.65 7.3 ± 0.67 7.0 ± 0.57 6.4 ± 0.35
Дыхательный объем, мл 630 ± 100.8 573 ± 96.7* 509 ± 76.2* 535 ± 93.4
Частота дыхания 14.0 ± 1.01 15.1 ± 1.01* 15.3 ± 1.06* 15.2 ± 1.13
Потребление кислорода, мл/мин/кг 5.7 ± 0.36 5.8 ± 0.47 5.4 ± 0.41 5.0 ± 0.39
Выделение углекислого газа, мл/мин/кг 4.0 ± 0.40 3.8 ± 0.36 3.5 ± 0.25 3.2 ± 0.23
Коэффициент экстракции кислорода, мл 5.1 ± 0.28 5.3 ± 0.29 5.1 ± 0.31 5.0 ± 0.26
Дыхательный коэффициент 0.68 ± 0.020 0.64 ± 0.015* 0.65 ± 0.018* 0.64 ± 0.022
Обследованные лица с генотипом ОС
Температура кожи левого предплечья, °С 32.0 ± 0.18 26.9 ± 0.74
Температура кожи правого предплечья, °С 32.2 ± 0.19 32.1 ± 0.13 26.5 ± 0.54
Минутный объем дыхания, л/мин 8.0 ± 0.60 6.0 ± 0.63* 4.8 ± 0.72* 5.0 ± 0.66
Дыхательный объем, мл 626 ± 89.0 520 ± 53.6 400 ± 91.0* 448 ± 110.0
Частота дыхания 13.2 ± 1.07 12.8 ± 1.54 12.7 ± 1.43 13.6 ± 2.56
Потребление кислорода, мл/мин/кг 6.9 ± 1.15 5.0 ± 0.57* 3.7 ± 0.97* 4.1 ± 1.15
Выделение углекислого газа, мл/мин/кг 4.6 ± 0.42 3.2 ± 0.50* 2.4 ± 0.60* 2.7 ± 0.73
Коэффициент экстракции кислорода, мл 5.9 ± 0.48 5.8 ± 0.40 5.0 ± 0.60* 4.7 ± 0.64
Дыхательный коэффициент 0.64 ± 0.02 0.65 ± 0.02 0.65 ± 0.03 0.64 ± 0.03
* Достоверность парного сравнения с исходными величинами при Р < 0.05.
газа и коэффициента экстракции кислорода, ни при тестовом охлаждении, ни после актив
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.