КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2014, том 59, № 6, с. 1015-1019
РОСТ ^^^^^^^^^^^^^^^^ КРИСТАЛЛОВ
УДК 548.523, 681.723.26 „ , , , ,
Посвящается Международному году кристаллографии
РЕАЛИЗАЦИЯ ИНТЕРФЕРЕНЦИИ В КОНФОКАЛЬНОМ ЛАЗЕРНОМ СКАНИРУЮЩЕМ МИКРОСКОПЕ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ in situ НАБЛЮДЕНИЙ ПРОЦЕССОВ РОСТА КРИСТАЛЛОВ
© 2014 г. В. В. Гребенев, А. Э. Волошин, М. С. Лясникова, Н.А. Дятлова
Институт кристаллографии РАН, Москва E-mail: vadim_grebenev@mail.ru Поступила в редакцию 17.04.2014 г.
Показана возможность реализации интерференции в оптической схеме лазерного сканирующего микроскопа Olimpus Lext-3000. В зависимости от условий эксперимента возникающие интерференционные картины имеют различную локализацию в пространстве. При определенных условиях возможно наблюдение интерференции от противоположных граней (объема) кристалла, что позволяет с высокой чувствительностью визуализировать дефекты, невидимые в поляризованном свете, и рельефа поверхности. Возможна оценка разориентировок и деформаций в кристалле. Проведенный анализ позволил интерпретировать наблюдавшуюся in situ интерференционную картину от растущих кристаллов белка лизоцима и кристаллов K2Co(SO4)2 • 6H2O.
DOI: 10.7868/S0023476114060113
ВВЕДЕНИЕ
При исследовании объектов интерферометри-ческими методами можно проводить измерения параметров рельефа поверхности кристаллов, плоскопараллельности пластин, коэффициентов преломления твердых и жидких сред, возможно также измерение скорости роста кристалла in situ в ходе кристаллизации. Как правило, подобные измерения проводятся на специально предназначенных для данного типа исследований приборах. Здесь стоит упомянуть микроинтерферометр или микроскоп интерферометрический. Такие приборы предназначены именно для наблюдения микрорельефа и распределения показателя преломления в прозрачных объектах. Промышленные интерферометры обеспечивают высокую точность (до X/200, где X — длина волны используемого излучения) измерения малых элементов рельефа поверхности в реальном времени. Однако при этом существует серьезная неоднозначность в интерпретации получаемых данных, поскольку система интерференционных полос не дает указаний на то, является ли наблюдаемый элемент рельефа поверхности впадиной или выпуклостью.
Конфокальные микроскопы также позволяют с высокой точностью анализировать рельеф поверхности, но измерение осуществляется за счет «послойного» сканирования поверхности при изменении положения объектива, что требует значительного времени. Это не позволяет проводить in situ наблюдения процессов, скорость которых выше, чем скорость построения трехмерной мо-
дели поверхности образца. При этом все элементы поверхности определяются однозначно.
Таким образом, совмещение в одном устройстве возможностей приборов, имеющих различные назначения (в данном случае интерферометра и конфокального микроскопа), позволяет расширить круг решаемых задач.
Возникновение интерференции в оптических системах, использующих для освещения объектов лазерное излучение, зафиксировано достаточно давно при наблюдении прозрачных (как правило, биологических) образцов. При использовании лазеров для возбуждения флуоресценции в конфокальных микроскопах (например, Leica, Olimpus и др.) также возникает интерференция, причем в данном случае она мешает наблюдению объектов. Поэтому в методических рекомендациях указано, что область детектирования не должна пересекаться с линией возбуждения флуоресценции.
Само по себе использование интерференции, возникающей при работе на конфокальных микроскопах, для получения информации о внутренней структуре объектов или о рельефе поверхности в литературе не упоминается. Поэтому цель настоящей работы заключается в изучении условий реализации интерференции в оптической системе конфокального микроскопа и демонстрации возможности получения информации об объекте на основе анализа возникающих интерференционных картин.
1016
ГРЕБЕНЕВ и др.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Эксперименты проводились с использованием микроскопа Olimpus Lext-3000, в котором в качестве источника света используется полупроводниковый лазер мощностью 1 мВт с длиной волны X = 408 ± 5 нм (по спецификации микроскопа, конечный производитель лазера неизвестен). В качестве объектов наблюдения использовались кристаллы белка тетрагонального лизоцима и кристаллы соли K2Co(SO4)2 • 6H2O с характерными размерами 0.35 х 0.25 х 0.08 и 0.5 х 0.4 х 0.1 мм.
Как известно, в интерферометрах интерференция обеспечивается разделением светового пучка на опорный и взаимодействующий с образцом. При использовании конфокального микроскопа разделения не происходит, и разность хода интерферирующих пучков обеспечивается разными отражениями на самом образце. Для того чтобы понять природу интерференции в оптической системе конфокального микроскопа, определить условия ее возникновения и разработать методику расчета по наблюдаемым интерференционным картинам параметров рельефа поверхности, проводились следующие эксперименты:
— определение условий возникновения интерференции. Наблюдение интерференции от предметного стекла и капли раствора на предметном стекле;
— in situ наблюдение интерференции в растворе при росте кристаллов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Определение условий возникновения интерференции. Наблюдение интерференции от предметного стекла и капли раствора на предметном стекле.
м:
Рис. 1. Схема эксперимента по наблюдению интерференции на конфокальном микроскопе от предметного стекла: 1 — объектив микроскопа, 2 — плоскость фокусировки объектива, 3 — световой конус объектива, 4 — предметное стекло, к — глубина резко изображаемого пространства объектива.
Интерференция была обнаружена при наблюдении в конфокальном режиме прозрачных объектов. Попробуем проанализировать условия наблюдения интерференции.
Оценка пространственной когерентности лазера (I = Х2/ДХ) дает значение I ~ 16.6 мкм, т.е. величина пространственной когерентности много меньше размеров объектов (I ~ 1 мм). При этом в виду отсутствия данных производителя о реальном распределении длин волн лазера в пучке принимали ДХ = 10 нм, хотя пространственная когерентность зависит от эффективного значения ДХ, учитывающего реальное распределение интенсивности по длинам волн [1], в данном случае в интервале Х = 408 ± 5 нм.
Второй важный вопрос — эффективность конфокальной диафрагмы микроскопа, определяющей аксиальную толщину, вне которой свет подавляется диафрагмой. Этот фактор определяет аксиальные размеры образца, при которых возможно наблюдение интерференции.
Эффективность диафрагмы зависит от размера отверстия диафрагмы и разрешения оптической системы в аксиальной плоскости [2]. Оптическое разрешение в аксиальной плоскости в данном случае много меньше размера исследуемых объектов и его можно не учитывать. Таким образом, контраст интерференционной картины будет зависеть только от размера отверстия конфокальной диафрагмы. Для объективов с малым увеличением (5Х—20Х) используются диафрагмы больших размеров, поэтому в конфокальном режиме можно целиком наблюдать объекты, имеющие толщину к ~ 1 мм. Для объективов 50х—100х размеры отверстия диафрагмы значительно меньше, контраст высокий, но интерференции не наблюдается, так как аксиальные размеры объекта больше конфокальной толщины в аксиальной плоскости: отраженный свет от верхней и нижней граней кристалла отсекается конфокальной диафрагмой и интерференции не происходит.
Практически максимальная контрастность интерференционной картины наблюдалась в условиях, когда размеры объекта сравнимы с глубиной резко изображаемого пространства объектива (ГРИП), т.е. в проведенных экспериментах для объективов 5Х—20Х максимальная эффективность конфокальной диафрагмы в аксиальной плоскости реализуется для области пространства, приблизительно отвечающей ГРИП объектива.
Схема эксперимента по наблюдению интерференции от сухого предметного стекла приведена на рис. 1. Световой пучок падает на поверхность стекла практически нормально. На рис. 2а приведен вид интерференционной картины при положении плоскости фокусировки в объеме предметного стекла (справа от капли). При фокусировке ниже поверхности предметного стекла интерфе-
1
2
Рис. 2. Микрофотографии интерференционных картин: а — от капли воды на предметном стекле (стрелками указаны полосы равной толщины от предметного стекла), б — от центральной части капли ( — кольца Ньютона, — интерференция dl).
ренция не полностью отсекается конфокальной диафрагмой и присутствует как артефакт изображения (не показано). Изменение наклона предметного стекла не приводит к изменению интерференционной картины. Таким образом, можно сделать вывод о наблюдении интерференционных полос равной толщины. Можно оценить и эффективную длину когерентности лазера: толщина предметного стекла составляет 1.2 мм, следовательно, нижний предел пространственной когерентности составляет также 1.2 мм.
На рис. 2 приведены фотографии интерференционных картин от капли воды, а на рис. 3 — схема эксперимента. В зависимости от положения высоты объектива, т.е. от локализации области ГРИП по отношению к образцу, можно наблюдать интерференционные картины для разностей хода лучей А1 и А4 как по отдельности, так и вместе (рис. 2а соответствует области наблюдения 1, а рис. 2б — области 4), а также интерференцию от поверхности капли (рис. 2б). Рисунки для областей наблюдения 3 и 4 здесь не приводятся, так как они малоинформативны и на них наблюдается только интерференция от поверхности капли, другие типы интерференционных картин в данном случае практически полностью исключаются конфокальной диафрагмой микроскопа. Интерференция от поверхности капли — это интерференционные полосы равного наклона, так как световой пучок, выходящий из объектива, — сходящийся и имеет форму конуса, то есть на по-
верхность капли, имеющеи свою кривизну, лучи попадают под разными углами. Интерференция d1 хорошо видна на рис. 2б и представляет собой хорошо известные кольца Ньютона.
Таким образом, используя комбинацию "положение плоскости фокусировки по отношению к образцу — ГРИП" (зависит от используемого объектива) можно наб
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.