ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 2, с. 174-185
= РЕГЕНЕРАЦИЯ =
УДК 591.862:615:57.089.64:577.34
РЕГЕНЕРАЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ И СОСТОЯНИЕ ТИМУСА У МОЛОДЫХ И СТАРЫХ МЫШЕЙ mdx
В УСЛОВИЯХ ТРАВМЫ МЫШЦЫ И КСЕНОПЛАСТИКИ РАНЕВОГО ДЕФЕКТА
© 2008 г. Н. В. Булякова*, М. А. Стенина**, В. С. Азарова*, Л. И. Кривов**, В. И. Савчук**
* Институт проблем экологии и эволюции им. АН. Северцова РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33 E-mail: admin@sevin.ru ** Российский государственный медицинский университет Росздрава, 117997 Москва, ул. Островитянова, 1 E-mail: rsmu@rsmu.ru Поступила в редакцию 22.03.2007 г.
Исследовали реакцию скелетной мышечной ткани и тимуса мышей mdx в возрасте 12-16 нед и 4048 нед на травму (полная поперечная перерезка мышцы) и ксенопластику раневого дефекта с помощью измельченной мышечной ткани новорожденных крысят (тканевая терапия). В мышечной ткани мышей mdx имеются генетические нарушения, вызывающие хроническое течение дистрофических процессов в мышце. Показано, что у молодых мышей mdx сохранялась сравнительно высокая способность мышечной ткани к регенерации. В условиях тканевой терапии раневого дефекта наблюдалось формирование мышечных волокон из мышечных клеток ксеноимплантата и активная регенерация мышечных волокон мышей-реципиентов. Структурных разрушений в тимусе не наблюдалось. У старых мышей mdx способность мышечной ткани к посттравматической регенерации была ниже, чем у молодых. Ксеноимплантат подвергался резорбции, подавлял регенерацию мышечных волокон мышей-реципиентов и вызывал деструкцию мышечной ткани в травмированной мышце. В паренхиме тимуса отмечены дегенеративные изменения: появлялись пустоты, очаги геморрагии, увеличивалось число макрофагов и тучных клеток.
Имплантация мышечной ткани в травмированную мышцу (метод тканевой терапии) способствует улучшению восстановительного процесса в области мышечной пластики. С помощью ауто-подсадки измельченной мышечной ткани показано довольно успешное восстановление обширных сквозных мышечных дефектов как в не облученных, так и в облученных ионизирующей радиацией скелетных мышцах лабораторных животных (Студитский, Игнатьева, 1961; Попова, 1984). Дефект в мышце заполняется отрастающими после травмы мышечными волокнами, а также мышечными волокнами, регенерирующими из ауто-трансплантированной мышечной ткани, содержащей клетки-сателлиты (предшественники миогенеза).
В данной работе был изучен эффект метода тканевой терапии травмированных мышц у мышей mdx, которые уже рождаются с генетическими нарушениями мышечной ткани. В результате мутации гена, локализованного в Х-хромосоме, в сарколемме мышечных волокон отсутствует белок дистрофин, что вызывает прогрессирующее развитие дистрофии мышц, снижение прочности мышечных волокон во время их сокращения и
расслабления, разрывы плазмолеммы (Tanabe et al., 1986; Rybakova et al., 2000). Первые признаки дистрофии мышц задних конечностей появляются у мышей-самцов mdx вскоре после рождения (примерно с 2-недельного возраста). В этот период, как известно, животное прозревает и возрастает его двигательная активность. В мышечной ткани наблюдаются одновременно очаги дегенерации (гиперсокращение, ценкеровский некроз мышечных волокон) и признаки спонтанной регенерации мышечной ткани (образование мио-симпластов и мышечных трубочек с цепочкой центрально расположенных ядер, молодые мышечные волокна). Однако в регенерирующих мышечных волокнах также отсутствует белок дистрофин (Jejurikar, Kuzon, 2003). В большинстве из них при достижении нормального диаметра ядра остаются расположенными центрально (Anderson et al., 1987). Постоянно происходящие в мышечной ткани процессы дегенерации и спонтанной регенерации мышечных волокон, ускорение циклов пролиферации клеток-сателлитов способствуют быстрому старению мышечных клеток и их гибели путем апоптоза (Tidball et al., 1995; Sandri et al, 1998; Jejurikar, Kuzon, 2003). В
эндомизии увеличивается количество фибробла-стов, проникают макрофаги, тучные клетки, лейкоциты.
С возрастом у мышей mdx уменьшаются величина скелетных мышц, количество мышечных волокон, отмечается вариабельность их по величине, усиливается склеротизация мышечной ткани (Bourke et al., 1988). Снижается количество клеток-сателлитов и их пролиферативная активность, реже встречаются очаги спонтанной дегенерации и регенерации мышечных волокон (Tanabe et al., 1986; Anderson et al, 1987; Heslop et al, 2000).
Известно, что процессы посттравматической регенерации в тканях находятся под иммунологическим и цитогенетическим контролем клеток лимфоидной ткани, в частности, клеток тимуса, как центрального органа иммунной системы (Бабаева, 1985). На основании собственных экспериментальных данных и данных литературы автор показала, что в период регенерации поврежденных тканей в связи с появлением новых антигенов, повышается уровень антител, циркулирующих в крови. Лимфоциты приобретают способность усиливать пролиферативную активность клеток регенерирующих нелимфоидных тканей, выделяя ростстимулирующие факторы (лимфо-кины).
Кроме того, недавно было показано, что мио-идные клетки тимуса могут мигрировать на периферию и участвовать в процессах посттравматической регенерации мышечной ткани (Wong et al., 1999; Pagel et al., 2000).
Данных о роли клеток лимфоидной ткани в регуляции восстановительных процессов, происходящих в травмированной мышечной ткани мышей mdx мы не встречали. Вопрос о состоянии иммунной системы обсуждают преимущественно в аспекте возможного отторжения предшественников миогенеза, вводимых с целью лечения мышечных дистрофий (Davis et al., 1993). В связи с этим встает необходимость оценить реакцию иммунной системы у мышей mdx как на внешнюю травму мышцы, так и на пластику раневого дефекта с помощью метода тканевой терапии.
Целью данного исследования было изучение регенерационной способности мышечной ткани и реактивных изменений в тимусе у молодых половозрелых и старых мышей mdx после внешнего повреждения икроножной мышцы, а также имплантации в область мышечной травмы измельченной мышечной ткани от новорожденных крысят.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперимент проведен на 18 самцах мышей mdx из колонии, поддерживаемой в Российском государственном медицинском университете.
Изучены две возрастные группы животных: молодые 12-16 нед (1-я группа) и старые 40-48 нед (2-я группа). В каждой возрастной группе у одних животных полностью перерезали икроножные мышцы по средней линии, сохраняя неповрежденными сосуды и нервы, идущие к другим мышцам: нервно-сосудистый пучок, лежащий на поверхности мышцы, и находящийся под ней малоберцовый нерв. Затем зашивали хирургическим шелком только края кожной раны (контроль 1 и контроль 2 в соответствии с возрастными группами). У других животных после такой же операции в область травмы перерезанной мышцы имплантировали измельченную мышечную ткань, полученную из обеих икроножных мышц 1-2-суточных крысят, не вызывающей выраженного иммунного конфликта в течение первых 5 сут после рождения (опыт 1 и опыт 2 также в соответствии с возрастными группами). Мышечная ткань новорожденных крысят содержит до 3040% клеток-сателлитов (миобластов), являющихся источником регенерации мышечной ткани (Hellmuth, Allbrook, 1971). Мышцы у новорожденных крысят извлекали в момент операции. Затем в стерильных условиях в чашке Петри измельчали их ножницами до состояния "фарша" и заполняли им область травмы между проксимальной и дистальной мышечными культями. Операцию проводили под нембуталовым наркозом.
Были изучены гистоструктурные особенности регенерирующих икроножных мышц и тимуса у оперированных мышей mdx, а также интактных мышей mdx соответствующего возраста. Мышечные регенераты и тимус животных исследовали через 2 нед после операции, когда гистологическая картина в травмированной мышце позволяет, в целом, оценить динамику регенерационного процесса как в мышечной ткани реципиента, так и состояние мышечной ткани донора, а также характер реактивных изменений в тимусе. Материал обрабатывали методами классической гистологии. Мышцы и тимус фиксировали в смеси Карнуа, парафиновые срезы толщиной 7-8 мкм окрашивали железным гематоксилином по Рего с докраской по Маллори. В тимусе определяли митотический индекс (МИ) тимоцитов (%е) и число лимфоцитов, подвергавшихся пикнозу (%), исходя из общего количества клеток, просчитанных в корковом и мозговом слоях вместе (примерно 5000 клеток). С этой целью просматривали по 8-10 гистологических срезов. На каждом гистологическом срезе в корковом и мозговом слоях тимуса произвольно выбирали по 2 поля зрения. У каждого животного было просчитано в корковом слое 3000-3500 клеток, в мозговом слое 1800-2000 клеток. Определяли также массу тимуса (в процентах от массы тела мыши). Количественные данные обрабатывали статистически и различия средних оценивали по критерию Стьюдента.
Рис. 1. Структура мышцы интактных мышей в возрасте 12-16 нед: а - гиперсокращение (Гп), ценкеровский некроз (ЦН), рыхло лежащие миофибриллы (РЛМ); б - регенерирующее мышечное волокно (РМВ) в области восстановления мышечной ткани. Ув.: х400.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Мышцы мышей тйх в возрасте 12-16 нед. У интактных мышей этой возрастной группы в мышечной ткани среди мышечных волокон, имеющих нормальное строение, выявлялись очаги дегенерации, в которых отмечались гиперсокращение, ценкеровский некроз мышечных волокон, более рыхлое расположение миофибрилл в волокне (рис. 1а) и очаги спонтанной регенерации мышечной ткани, где отмечались неширокие молодые мышечные волокна с крупными овальными мышечными ядрами (рис. 16).
Через 2 нед после полной поперечной перерезки икроножных мышц (контроль 1) область дефекта была заполнена грануляционной тканью, содержащей коллагеновые волокна и активно делящиеся фибробласты. Отмечалась умеренная лейкоцитарная инфильтрация. На концах перерезанных мышечных волокон наблюдалась активная регенерация мышечной ткани: скапливались мышечные ядра, в сторону дефекта росли многоядерные миосимпласты и мышечные трубочки. Рост миогенных элементов наблюдался также в расширенных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.