научная статья по теме РЕГЕНЕРАЦИЯ ЭНДЕМИЧНОГО ВИДА FRITILLARIA SONNIKOVAE ИЗ ЛУКОВИЧНЫХ ЧЕШУЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO Биология

Текст научной статьи на тему «РЕГЕНЕРАЦИЯ ЭНДЕМИЧНОГО ВИДА FRITILLARIA SONNIKOVAE ИЗ ЛУКОВИЧНЫХ ЧЕШУЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO»

ОНТОГЕНЕЗ, 2015, том 46, № 4, с. 259-266

= МОРФОГЕНЕЗ

УДК 581.143.6

РЕГЕНЕРАЦИЯ ЭНДЕМИЧНОГО ВИДА FRITILLARIA SONNIKOVAE ИЗ ЛУКОВИЧНЫХ ЧЕШУЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO © 2015 г. Д. С. Кульханова, А. А. Эрст, Т. И. Новикова

Центральный Сибирский ботанический сад Сибирского отделения РАН, 630090 Новосибирск, ул. Золотодолинская, д. 101 E-mail: dinarakulkhanova@yandex.ru Поступила в редакцию 15.05.2014 г.

Окончательный вариант получен 21.01.2015 г.

Исследованы особенности регенерации Fritillaria sonnikovae из луковичных чешуй в культуре in vitro. Инициация побегообразования была получена на питательной среде BDS, дополненной 5 мкМ 6-бензиламинопурина и 2 мкМ а-нафтилуксусной кислоты. Оптимизацию стадии собственно размножения проводили с использованием в качестве эксплантов полученных микролуковичек. Высокий регенерационный ответ эксплантов и коэффициент размножения наблюдали как на средах, содержащих регуляторы роста (до 47% и 4.2 ± 0.6 шт./экспл. соответственно), так и на безгормональной питательной среде (48% и 4.1 ± 0.2 шт./экспл. соответственно). Установлено, что внесение регуляторов роста на этапе культивирования не вызывает усиления морфогенного ответа, но способствует ускоренному заложению и развитию микролуковичек. Морфо-гистологический анализ позволил выявить динамику формирования побегов de novo. Развитие F. sonnikovae в культуре in vitro идет по пути прямого органогенеза из эпидермальных тканей экспланта.

Ключевые слова: Fritillaria sonnikovae, регенерация in vitro, морфо-гистологический анализ, луковичные чешуи, сохранение биоразнообразия.

DOI: 10.7868/S0475145015040059

ВВЕДЕНИЕ

Рябчик Сонниковой (Fritillaria sonnikovae Schaulo et A. Erst, сем. Liliacea), эндемик гор Южной Сибири, впервые был описан в 2010 г. на территории Саяно-Шушенского государственного природного биосферного заповедника (Шауло, Эрст, 2010). Представители рода Fritillaria имеют высокий потенциал как декоративные культуры, используются для озеленения и в срезке. Кроме того, известны лекарственные свойства рябчиков, они применяются в традиционной медицине в качестве отхаркивающих, жаропонижающих и общетонизирующих средств (Mohammadi-Dehcheshmeh et al., 2007; Каирова и др., 2010). Однако в связи с медленным размножением в естественных условиях и высокой антропогенной нагрузкой на природные фитоценозы, многие виды данного рода находятся под угрозой исчезновения. Применение методов биотехнологии, а именно размножение растений in vitro, является решением проблем воспроизводства редких и исчезающих видов, растений с затрудненным размножением и массового получения ценных генотипов (Benson et al., 2000; Новикова и др., 2008; Ветчинкина, 2012).

Фундаментальной основой этих технологий являются исследования процессов морфогенеза в

культуре in vitro, реализующихся благодаря тоти-потентности растительных клеток. Существует два основных морфогенетических пути, приводящих к регенерации целого растения из соматических тканей — органогенез и соматический эмбриогенез (Phillips, 2004). Оба пути морфогенеза могут протекать как с промежуточной стадией каллусообразования (непрямая регенерация), так и без нее (прямая регенерация). Предпочтительным путем морфогенеза для воспроизводства редких и исчезающих видов, позволяющим избежать сомаклональной изменчивости и сохранить идентичность полученных клонов материнским растениям, является прямая регенерация (Varsh-ney et al., 2001; Bublyk et al., 2012; Yin et al., 2013).

Органогенез (геммогенез и ризогенез) в культуре ткани характеризуется образованием побегов и корней de novo или их развитием из имеющихся меристем. При этом сформированные органы образуют сосудистую связь с тканью первичного экспланта в противоположность соматическим эмбриоидам, которые являются новыми, индивидуально возникшими из соматических клеток биполярными структурами, развивающимися по подобию зиготических зародышей (George et al., 2008). Органогенез и соматический

Влияние регуляторов роста на регенерацию луковичек F. sonnikovae в культуре in vitro

Регулятор роста, мкМ Регенерация, % Количество побегов на эксплант, шт

Без гормонов 48 4.1 ± 0.2

(контроль)

БАП 5 40 3.3 ± 0.6

БАП 5 + НУК 2 37 4.2 ± 0.6

БАП 10 + НУК 2 47 3.1 ± 0.5

ТДЗ 5 + НУК 2 30 3.9 ± 1.4

ТДЗ 10 + НУК 2 43 3.6 ± 1.2

эмбриогенез могут служить модельными системами для изучения морфогенеза растений, поскольку его пути как в естественных условиях in vivo, так и в условиях культуры in vitro универсальны (Батыгина и др., 2010).

Исследованиям процессов морфогенеза в культуре in vitro представителей рода Fritillaria и оптимизации протоколов микроразмножения на их основе посвящено несколько работ. Так установлено, что у F. meleagris при использовании в качестве первичных эксплантов зрелых зиготиче-ских зародышей и оснований листа происходит непрямой и прямой соматический эмбриогенез соответственно (Subotic et al., 2010; Petric et al., 2011). Другой путь морфогенеза, прямой геммо-генез в культуре in vitro отмечался у F. unibracteata и F. imperialis (Gao et al., 1999; Mohammadi-Deh-cheshmeh et al., 2008).

Целью данной работы явилось изучение особенностей регенерации F. sonnikovae в культуре in vitro из тканей луковичных чешуй.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исходным материалом для введения в культуру in vitro послужили луковицы F. sonnikovae, соответствующие генеративной фазе развития, полученные из естественных мест произрастания (Россия, Красноярский край, хребет Борус). Стерилизацию луковичных чешуй осуществляли погружением в 70% этанол (30 с), затем 0.1% HgCl2 с добавлением 1% Tween 80 (30 мин). Далее растительный материал трехкратно промывали стерильной дистиллированной водой, делили на части размером 5 х 5 мм и использовали в качестве первичных эксплантов. Питательной средой для введения в культуру in vitro явилась минеральная основа по прописи Данстена и Шорта (BDS) (Dunstan, Short, 1978), дополненная 5 мкМ 6-бен-зиламинопурина (БАП) и 2 мкМ а-нафтилуксус-ной кислоты (НУК). Стадию размножения (мультипликацию побегов) проводили на среде BDS, дополненной различными регуляторами роста

(таблица). В качестве контрольной среды использовали безгормональную среду BDS. Культивирование растительного материала проводили в условиях 16 ч свет/8 ч темнота при 23°С по общепринятым методикам (Калинин и др., 1980). Период субкультивирования составил 30—35 дней.

Онтогенетическое состояние полученных микролуковичек определяли согласно схеме жизненного цикла Л.Л. Седельниковой (2002).

В работе по изучению морфогенеза использовали сегменты чешуй микролуковичек F. sonnikovae размером 5 х 5 мм из культуры тканей. Для ускорения морфогенного ответа экспланты помещали на агаризованную питательную среду по прописи BDS, дополненную 5 мкМ БАП в сочетании с 2 мкМ НУК. Фиксировать растительный материал для последующего морфо-гистологиче-ского анализа начинали через 7—10 дней культивирования с периодичностью 3—5 дней. Изучение процессов морфогенеза проводили на постоянных препаратах, подготовленных по методике З.П. Паушевой (1988). Для этого растительный материал фиксировали в FAA — этанол: формалин: ледяная уксусная кислота (100 : 7 : 7). Промывку и дальнейшее хранение осуществляли в 70% этаноле. Далее фиксированный материал подготавливали для заливки в парафин, проводя через этанол, смесь этанола и хлороформа, хлороформ. Тонкие срезы (7—9 мкм) получали на ротационном микротоме Microm HM 325 (Thermo Scientific, США), затем их помещали на предметные стекла и окрашивали гематоксилином по Эр-лиху с подкраской анилиновым синим. Гистологический анализ развития растений проводили с помощью светового микроскопа Axioskop-40 (Carl Zeiss, Германия) с программным управлением, оборудованным цифровой камерой. Полученные при культивировании in vitro морфоген-ные структуры и динамику их развития анализировали с помощью стереомикроскопа Carl Zeiss Stereo Discovery V 12.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Статистическая обработка результатов. Все

эксперименты проводились в 2—3 повторностях. При обработке результатов использовали пакет статистического анализа Microsoft Excel. В таблице приведены средние арифметические величины и доверительные интервалы. В работе обсуждаются различия, достоверные при 95%-ном уровне значимости.

Регенерация F. sonnikovae в культуре in vitro

Применяемый режим стерилизации оказался эффективным, выход неинфицированных экс-плантов составил 96% процентов. Использование питательной среды, содержащей регуляторы роста растений, стимулировало процессы регенерации в

Рис. 1. Органогенез микролуковичек F. sonnikovae из сегментов луковичных чешуй на среде BDS, дополненной БАП 5 мкМ и НУК 2 мкМ. а — заложения почек, 11—15 дней; б — побег на 19 день культивирования; в — микролуковички с развитыми чешуями, 20—24 дней; г — побеги, находящиеся на разной стадии развития, 31 день.

тканях первичного экспланта и через 45—50 дней после введения в культуру in vitro при культивировании на среде BDS, дополненной БАП 5 мкМ и НУК 2 мкМ, отмечалось начало морфогенной активности (рис. 1а). Сформированные адвентивные микролуковички отделяли от первичного экспланта и переносили на среды для собственно размножения.

Основные результаты влияния регуляторов роста на регенерацию микролуковичек F. sonnikovae приведены в таблице. На испытанных средах каллусогенез отсутствовал, однако отмечали незначительный некроз тканей в зоне их контакта с питательной средой. Регенерационный ответ на всех испытанных средах варьировал от 30 до 48%, количество адвентивных луковичек — от 3.1 ± 0.5 до 4.2 ± 0.6 шт./экспл. На контрольной безгормональной среде наблюдали высокие показатели роста и развития микролуковичек на протяжении длительного периода культивирования (два года). Внесение в питательную среду экзогенных регуляторов роста на стадии собственно размножения не сопровождалось увеличением активности побегообразования для F. sonnikovae в культуре in vitro, но способствовало ускоренному процессу регенерации растений. Так, добавление 5 мкМ БАП и 2 мкМ НУК на данном этапе вызывало начало формирования микропочек на поверхности чешуи

через 12—17 дне

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»