БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 591.862:615:57.089.64:577.34
РЕГЕНЕРАЦИЯ МЫШЦ И СОСТОЯНИЕ ТИМУСА ВЗРОСЛЫХ КРЫС ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЛАЗЕРА И ИМПЛАНТАЦИИ ИКРОНОЖНЫХ МЫШЦ И ДИАФРАГМЫ НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ
© 2010 г. Н. В. Булякова, В. С. Азарова
Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33
E-mail: admin@sevin.ru Поступила в редакцию 05.02.2010 г.
Исследовали восстановление икроножных мышц у взрослых крыс в условиях имплантации в область повреждения мышечной ткани новорожденных крысят. Аллопластику проводили с помощью измельченных икроножных мышц и мышц диафрагмы, различающихся к моменту рождения животных по степени дифференцировки. С целью снижения иммунной реактивности реципиента область пластики до операции облучали He-Ne лазером. Показано, что из имплантированных икроножных мышц образуется большее количество мышечных волокон, чем из имплантированных мышц диафрагмы. Однако на протяжении всего срока исследования в области аллопластики наблюдались очаги жировой, хрящевой и костной тканей. При имплантации мышц диафрагмы узелки хрящевой ткани отмечались только в 7-суточных регенератах. К концу наблюдения в первом случае область травмы в мышцах взрослых крыс подвергалась жировому перерождению, в том числе и в условиях предварительного лазерного облучения. При аллопластике диафрагмальных мышц она заполнялась регенерирующей мышечной тканью.
Для улучшения регенерации поврежденных мышц биологами и клиницистами разрабатываются различные методологические подходы. Одним из таких является метод клеточной терапии: введение в поврежденную мышцу стволовых клеток, миобластов, предварительно выращенных в культуре. Миобласты, выделенные из мышечной ткани эмбриона, новорожденного или взрослого животного, могут участвовать в восстановлении скелетных мышц (Watt гг а1., 1982; Ииагё гг а1, 1994; Ко гг а1, 1998; Сухих и др., 2001; Ие81ор гг а1, 2001). Эффект получен в условиях имплантации ауто- , алло- и ксеногенных миобластов.
Описан положительный эффект метода тканевой терапии: имплантация в область повреждения скелетной мышцы мышечного фрагмента, извлеченного у животного в момент операции и измельченного перед пластикой. В область травмы вместе с окружающими тканями, содержащимися в мышечном фрагменте, привносятся так называемые регионарные мышечные клетки-сателлиты, являющиеся источником регенерации мышечных элементов. Установлено, что в ходе регенерации сохранившие жизнеспособность клетки-сателлиты, лежащие под базальной мембраной мышечных фрагментов, превращаются в миобласты, делятся, сливаются и формируют новые мышечные волокна. Улучшение регенерации показано в условиях аутопластики области травмы как необлученных мышц, так и локально облученных ионизирующей радиацией в дозе 20 Гр
(Студитский, Игнатьева, 1961; Попова, 1984; Булякова и др., 1995). Получен положительный эффект аллопластики измельченной мышечной ткани от взрослой крысы в область повреждения предварительно облученной лазером мышцы другой крысы того же возраста (Булякова, Азарова, 2009). Показано также, что измельченная мышечная ткань икроножных мышц новорожденных крысят, имплантированная в область травмы икроножной мышцы половозрелых мышей шёх (ксенопластика), способна к прогрессивному развитию в течение первых 14 сут после операции (Булякова и др., 2008).
Реакция реципиента на трансплантат носит генерализованный характер (Абелев, 1996). Лимфо-идные органы участвуют в распознавании чужих для организма антигенов. Повышается продукция иммунных клеток и гуморальных факторов, играющих существенную роль в индукции трансплантационного иммунитета и реализации реакций отторжения трансплантата. Тимус как центральный орган иммунной системы принимает активное участие в выработке трансплантационного иммунитета. В корковом слое тимуса происходит созревание тимоцитов. Зрелые Т-лимфо-циты поступают из тимуса в кровь и включаются в рециркуляцию с прохождением через периферические лимфоидные органы. В ответ на контакт с антигеном происходит повышение проли-феративной активности лимфоцитов и усиление их дифференцировки в направлении клеток-эф-
фекторов. Мигрирующие на периферию тимоци-ты CD4 и CD8, берут на себя основные защитные и регуляторные функции.
Имплантация генетически чужеродных тканей возможна при введении иммунодепрессантов (Watt et al, 1982; Davis et al, 1993; Ito et al, 1998; Wang et al., 2005). Согласно данным литературы, на иммунную систему организма может оказывать влияние лазерное излучение. Многие исследователи на различных экспериментальных моделях отмечали снижение трансплантационного иммунитета при определенных условиях и дозах воздействия лазера. Было установлено, что низкоинтенсивное лазерное излучение может повышать выживаемость чужеродных тканей, прежде всего за счет снижения чувствительности Т-лим-фоцитов к чужеродному антигену и подавления активности антителообразования в В-лимфоцитах (Mester et al., 1978; Кармолин, Калина, 1982; Федорчук, Скивка, 1989).
Определенный интерес представляет метод тканевой терапии с помощью мышечной ткани новорожденных. Ткани новорожденных животных в течение первых трех суток обладают наименьшей антигенностью. Однако известно, что у позвоночных существует кранио-каудальный градиент дифференцировки скелетной мышечной ткани. К моменту рождения животного мор-фофункциональные особенности мышечной ткани в скелетных мышцах могут существенно различаться. Например, гистогенез в задних конечностях крысят и кроликов менее продвинут, чем в межреберных мышцах и диафрагме (Данилов, 1975; Geissinger et al., 1984; Yamashiro et al., 1984). У новорожденных крысят в икроножных мышцах выявляется значительная популяция незрелых мышечных волокон с центрально расположенными ядрами и небольшим количеством рыхло лежащих миофибрилл. Количество мышечной и соединительной тканей в икроножных мышцах новорожденных, 10-суточных и взрослых крыс равно 1 : 1.07, 1 : 1.38 и 1 : 0.45 соответственно (Данилов, 1975). Отмечается полинейронная иннервация (Hall, 1982). Диафрагмальная мышца у новорожденных содержит сформированные нервно-мышечные контакты, она функционально более активна и способна к непрерывному сокращению (Gottschall, 1981; Yamashiro et al., 1984). В отличие от мышц задних конечностей в ней нет развитой внутренней соединительнотканной организации (Davis, Jasmin, 1993). В скелетных мышцах задних конечностей новорожденных крысят число клеток-сателлитов в среднем равно 30% (Bischoff, 1994). Количество сател-литных клеток, потенциально способных к синтезу ДНК, в большеберцовой мышце и диафрагме составляет 4.11 ± 0.35 и 0.7 ± 0.1 соответственно (Данилов, 1975). Возникает вопрос: одинакова ли
пластичность мышечной ткани у новорожденных животных.
Целью данного исследования было оценить эффективность аллопластики измельченной мышечной ткани новорожденных крысят как метода тканевой терапии травмированных мышц у взрослой крысы, а также дать сравнительную оценку пластичности мышечной ткани из разных мышц новорожденных крысят.
С целью снижения трансплантационного иммунитета у крыс-реципиентов животных до операции подвергали воздействию лазерного излучения. Параллельно проводили анализ функционального состояния тимуса как главного органа иммунной системы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперимент выполнен на 40 крысах (в возрасте 2—3 мес., вес тела 200—250 г). Крысы нелинейные, но популяция содержалась в обычных условиях вивария и в течение нескольких лет при разведении подвергалась близкородственному скрещиванию. У животных под нембуталовым наркозом в асептических условиях вскрывали кожу, кроющую мышцу и полностью перерезали икроножные мышцы, сохраняя неповрежденными нервно-сосудистый пучок, лежащий на поверхности мышцы, и подлежащий малоберцовый нерв. Затем у новорожденных крысят извлекали икроножные и диафрагмальные мышцы, измельчали ножницами в стерильных чашках Петри и имплантировали в область поперечной перерезки икроножных мышц реципиента, в каждую мышцу от 3—4 крысят, в правую конечность — мышечную ткань икроножных мышц, в левую — мышечную ткань диафрагмы. После аллопластики кроющую мышцу и кожу зашивали послойно хирургическим шелком. Возраст новорожденных крысят составлял 1.5—3 сут.
Эксперимент состоял из двух серий. В контроле аллопластику области травмы правой и левой икроножных мышц у взрослой крысы (контроль 1 и 2 соответственно) проводили без предварительного воздействия лазерного излучения. В опыте обе задние конечности в области проекции икроножных мышц подвергали до операции курсовому воздействию излучения Не-№ лазера (ОКГ-12, Россия) (опыт 1 и 2 соответственно). Условия воздействия Не-№ лазера: длина волны 0.63 мкм, лазерный луч был расфокусирован с помощью линзы, диаметр поля облучения 2—2.5 см, плотность мощности составляла 2.5—3 мВт/см2. В течение 14 сут было проведено 10 экспозиций по 5 мин, ежесуточно за исключением выходных, суммарно в дозе 7.5—9 Дж/см2 на каждую конечность. В целом животное получало дозу, равную 15—18 Дж/см2. По нашим данным и данным лите-
ратуры при этой дозе лазерного воздействия снижается иммунная реактивность организма (Ха-рин, 1989; Булякова, Азарова, 2009).
Мышечные регенераты анализировали через 7, 14, 21 и 30 сут после операции. О качественных показателях восстановительного процесса в икроножной мышце судили по способности мышечного аллопланта к развитию, по регенераци-онной активности мышечной ткани крыс-реципиентов и гистологической структуре регенератов в целом.
Функциональное состояние тимуса оценивали по данным гистологического, цитологического и морфометрического анализа органа. Величину коркового и мозгового слоев в тимусе измеряли "методом полей" (Автандилов и др., 1981) с помощью тестовой окулярной сетки и бинокулярной лупы МБС-1 (ЛОМО, Россия) при увеличении х25. Подсчет проводили только в дольках, сохранивших свою структуру. Количество точек, приходящихся на корковый и мозговой слои, выражали в процентном отношении к общему количеству точек, подсчитанных на гистологическом срезе тимуса. Кроме того, в корковом слое определяли митотический индекс клеток тиму
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.