ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2012, том 59, № 3, с. 444-450
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 581.1
РЕГЕНЕРАЦИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН gfp НА СЕМЯДОЛЬНЫХ И ЛИСТОВЫХ ЭКСПЛАНТАХ РАПСА:
ВЛИЯНИЕ ГЕНОТИПА И АБК © 2012 г. Т. Ж. Хоанг*, Г. Н. Ралдугина**
*Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева, Москва **Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 16.02.2011 г.
Семядоли пятидневных проростков и листья шестинедельных растений двух сортов рапса (Brassica napus L., сорта Westar и Подмосковный) сокультивировали с культурой Agrobacterium tumefaciens, содержащей генетическую конструкцию с маркерным геном gfp, на МС-среде с добавлением БАП, НУК и АБК в разных сочетаниях. Способность к регенерации на обоих типах эксплантов была достаточно высока, но у листовых эксплантов сформированные побеги были слабо дифференцированы и у большинства наблюдалась витрификация. Частота регенерации на семядольных эксплантах обоих сортов растений-трансформантов, экспрессирующих ген gfp, была более 70%, однако она была значительно ниже при использовании листовых эксплантов (47% у сорта Вестар и 28% у сорта Подмосковный). Ген gfp экспрессировался на всех стадиях развития побега. На первичном начинающем дифференцироваться каллусе мы наблюдали наиболее сильную флуоресценцию белка GFP в меристематической и сосудистой тканях. На листовых пластинках свечение белка GFP было значительно ярче на старых листьях, чем на молодых, при этом оно часто наблюдалось только в группах клеток. При проведении ПЦР-анализа семенного поколения растений-трансформантов обнаружили, что у некоторых растений не соблюдались менделевские правила наследования моногенного признака (трансгена) для самоопыленных растений. Это явление может объясняться либо как результат мейотической рекомбинации, либо образованием при регенерации генотипических химер.
Ключевые слова: Brassica napus - регенерация - трансформация - gfp
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы широко разрабатываются методы биотехнологии, способствующие решению многих проблем селекционного процесса. Большие возможности в создании новых форм организмов дает использование методов генетической инженерии, предоставляющих возможность переносить чужеродные гены в реципиент-ные организмы, что позволяет преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим. Растения имеют важное преимущество перед животными - они обладают тотипотентностью, т.е возможна их регенерация in vitro из недифференцированных соматических тканей с получением нормальных фертильных растений. Это свойство дает возможность создания трансгенных растений и изучения функционирования введенных в растения генов. Как известно, одним
Сокращение: Цф - цефотаксим.
Адрес для корреспонденции: Ралдугина Галина Николаевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: galina@ippras.ru
из доказательств трансгенности является наследование встроенных генов, поэтому очень важно понять, по каким причинам в некоторых случаях чужеродные гены не наследуются в потомстве.
При изучении наследования в растениях чужеродных генов для большинства созданных трансгенных растений было показано, что встроенные гены при наличии одной копии, как правило, наследуются в потомстве самоопыленных трансгенных растений, сегрегируя в отношении 3 : 1, т.е. эти гены наследуются как единый менделевский признак. Однако в некоторых случаях наблюдалось наследование совершенно в других соотношениях, например, только в 3 из 50 семян трансгенного табака содержался встроенный ген прШ [1]. Такое явление очень затрудняет дальнейшую работу с полученными трансформированными растениями. Для того, чтобы исключить такое явление, необходимо понять причины, по которым у трансформированных растений не соблюдаются менделевские правила наследования моногенного признака. Одной из них может быть образование химер, т.е. организмов, состоящих из генетически неоднородных клеток.
Рй ьч
S s
О о " р
^ H <
35S
GFPs
13
к ЙЦ
3NTR Nos /
Рис. 1. Схема генетической конструкции, использованной для трансформации семядольных и листовых эксплантов рапса.
35S — последовательность промотора из генома вируса мозаики цветной капусты (35S CaMV); GFPs — последовательность модифицированного гена зеленого флуоресцентного белка; 3'NTR — З'-нетранслируемая последовательность; Nos — терминирующая последовательность гена нопалинсинтазы. Стрелками показаны рестрицирующие эндонуклеазы.
Химерность растений-трансформантов описана у некоторых травянистых видов, например, табака [1, 2], сои [3], картофеля [4], риса [5], льна [6], капусты [7] и земляники [8], а также у древесных плодовых растений, например, у яблони [9] или у цитрусовых [10]. Полученные в некоторых случаях химеры составляли до 90% растений-ре-генерантов. Авторы по-разному объясняют причины возникновения химерных растений: формированием побегов одновременно из трансформированных и нетрансформированных клеток [11, 12], последствиями защиты нетрансформи-рованных клеток от селективного агента окружающими трансформированными клетками [13, 14] или неэффективностью селективных агентов [15]. Однако этот вопрос совершенно не исследован, и авторы, показавшие образование химерных трансгенных растений, не обсуждали причины этого феномена.
Целью нашей работы являлся выбор условий, при которых регенерация трансформантов из семядольных или листовых эксплантов двух сортов ярового рапса происходила бы с наибольшей частотой с тем, чтобы в дальнейшем попытаться обнаружить зависимость формирования химерных растений от вида или генотипа экспланта. Для визуализации процесса формирования побегов трансформацию рапса проводили конструкцией, содержавшей ген gfp, который кодирует зеленый флуоресцирующий белок, светящийся при освещении ультрафиолетом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В экспериментах использовали семядоли и листья ярового рапса (Brassica napus L.) сортов We-star (канадской селекции) и Подмосковный (селекции ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса, любезно предоставленный сотрудниками этого института). Семядоли получали путем проращивания стерильных семян на среде, содержавшей макросоли по Murashige и Skoog [16] и 0.5% сахарозу без добавления растительных гормонов и витаминов. Все семена стерилизовали 70% спиртом и 20%
раствором гипохлорита натрия, после чего промывали стерильной дистиллированной водой, а затем высаживали на агаризованную среду (0.7% агар-агар) и помещали на сутки в темноту, после чего переносили в световую камеру. Через 5 суток срезанные с проростков семядольные листья использовали для получения эксплантов. Листовые экспланты получали со стерильных растений-ре-генерантов в возрасте 6 нед. Листовую пластинку с удаленной главной жилкой нарезали на сегменты по 5 мм и помещали нижней стороной на ага-ризованную среду для каллусогенеза (среда МС, 3% сахароза, 0.1 мг/л 2,4-Д, 4 мг/л кинетин, 2 мг/л НУК).
Для трансформации использовали генетическую конструкцию с геном (рис. 1) в плазмиде рА3011, находящейся в А£гоЬас1вгшт Штв/аавт штамма А0Ь0. Конструкция была получена от сотрудников кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Ген
содержал интрон, не позволяя ему экспресси-роваться в бактериях. Культуру агробактерий выращивали в течение ночи при 25-26°С на шейке-ре в жидкой среде ЬВ, содержавшей 50 мг/л ри-фампицина и 50 мг/л канамицина.
Трансформацию проводили методом совместного культивирования эксплантов с агробактери-ей, находящейся на поверхности агаризованной среды [17] по ранее разработанному методу [18]. Суспензию "ночной" культуры А. Штв/аавт наносили на среду для каллусогенеза, помещали на нее 5-дневные семядольные экспланты проростков или листовые сегменты по 30-40 штук на чашку и инкубировали в течение 2 суток в темноте при температуре 25°С. Затем экспланты переносили на среду для морфогенеза (среда МС, 1% сахароза, БАП, НУК), дополненную антибиотиком цефатоксимом (Цф) (800 мг/л) и АБК (3 мг/л) и помещали в световую камеру. После двухнедельного выращивания экспланты переносили на среду для морфогенеза без АБК, также дополненную Цф (500 мг/л). Через 2—3 нед. экспланты переносили на питательную среду для роста побегов (среда МС, 1% сахароза), дополненную Цф
Таблица 1. Влияние регуляторов роста на частоту регенерации у семядольных или листовых эксплантов двух сортов рапса
Концентрация регуляторов роста в среде, мг/л Частота регенерации, %
семядольные экспланты листовые экспланты
БАП НУК АБК Westar Подмосковный Westar
4 0 0 13.4 ± 0.1* 0 -
3 - 35. ± 12.0 -
0.5 0 11.7 ± 0.1 4.7 ± 0.1 -
3 89.0 ± 0.1 92.2 ± 0.1 -
1 0 18.3 ± 0.1 14.1 ± 0.2 -
3 83.. ± 0.1 37.5 ± 13.0 51.4 ± 17.2
8 1 0 lO. ± 0.1 6.9 ± 0.1 -
3 91.1 ± 0.1 72.7 ± 12.1 70.1 ± 14.7
5 1 3 - - 56. ± 17.9
Примечание. Знак (—) — не проверяли. Звездочка (*) — доверительный интервал.
(500 мг/л). Для листовых эксплантов в среду для морфогенеза добавляли 3 мг/л AgNO3. Сформированные побеги отделяли от каллуса и пересаживали на среду для укоренения, дополненную 300 мг/л Цф (1/2 концентрации макросолей, микросоли по МС, 1% сахароза, 0.1 мг/л НУК).
Флуоресценцию белка GFP наблюдали при освещении ткани синим светом (440—480 нм) с помощью микроскопов Axiophot и AxioImager ("Zeiss", Германия).
Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса бактериальных колоний [19]. Выделение ДНК из листьев растений-регенерантов проводили по методу Fulton с соавт. [20], растирая растительную ткань в жидком азоте. Для удаления РНК препарат ДНК обрабатывали РНКазой. Очищенную ДНК после оценки ее чистоты с помощью электрофореза в агарозном геле использовали для ПЦР, который проводили c использованием праймеров для гена gfp: прямой eGFP-FW 5'-CCTGAAGTTCATCTGCACCAC-3' и обратный eGFP-RV 5'-ACTCCAGCAGGACCATGTGAT-3', в амплификаторе Терцик ("ДНК-технология", Пущино), по следующему протоколу: 94°С — 4 мин, 30 циклов (94°С - 60 с, 64°С - 60 с, 72°С -60 с), 72°С - 4 мин.
Ампл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.