ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2008, том 418, № 3, с. 419-422
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 577.27
РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ ЗАЩИЩАЮТ НЕЙРОНЫ МОЗГА ОТ ГИПОКСИИ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VIVO
© 2008 г. Л. С. Козина, А. В. Арутшнян, С. Л. Стволинский, М. С. Степанова, М. Г. Маклецова, В. X. Хавинсон
Представлено академиком В.П. Скулачевым 11.07.2007 г. Поступило 30.07.2007 г.
Короткие пептиды, охарактеризованные в исследованиях, выполненных ранее в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН [1-3], обладают способностью защищать нейроны от окислительного стресса [4], однако в опытах in vitro их действие проявляется при высоких (милимолярных) концентрациях. Их прямая антиоксидантная активность невелика, и по этой причине биологический эффект может быть опосредован через природную систему антиоксидантной защиты [5]. Если это справедливо, протекторное действие этих пептидов в условиях целого организма может проявляться при концентрациях, приближенных к физиологическим. Проверка этого предположения и явилась темой настоящего исследования. Целью данной работы было изучение в экспериментах in vivo защитного влияния ряда коротких регуляторных пептидов (вилон, эпиталон, пинеалон и везуген) при окислительном стрессе, вызванном воздействием на животных гипобарической гипоксии.
В экспериментах использовали крыс-самцов линии Wistar массой 185-200 г. Окислительный стресс создавали с помощью острой гипобарической гипоксии, моделируя ее в барокамере с регулируемым протоком воздуха, что предотвращает развитие гиперкапнии [6]. С помощью вакуумного насоса давление в барокамере снижали за 1 мин до конечного значения 0.125 атм. В таких условиях животных выдерживали до остановки дыхания, после чего возвращали животных в условия нормального давления, подавая в камеру атмосферный воздух в течение 1 мин.
Регистрировали следующие параметры: время (с) до потери дыхания "на высоте"; время (с) вос-
Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук Научный центр неврологии Российской академии медицинских наук, Москва
становления позы, т.е. период времени от остановки дыхания до момента, когда животное после "спуска с высоты" и восстановления дыхания в условиях нормобарии восстанавливало нормальную позу; время (с) реституции, измеряемое как общая продолжительность периода восстановления физиологической активности после гипокси-ческого воздействия. Для выявления защитного действия исследуемых пептидов оценивали смертность и коэффициент реституции (отношение продолжительности времени реституции к времени до остановки дыхания в барокамере).
Для статистической обработки данных использовали критерии Крускала-Уоллиса и Ман-на-Уитни; достоверными считали отличия при p < 0.05.
Исследуемые пептиды вилон (Lys-Glu), везуген (Lys-Glu-Asp), пинеалон (Glu-Asp-Arg) и эпиталон (Ala-Glu-Asp-Arg) вводили в дозе 10 мкг/кг массы животного внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 сут, предшествующих гипоксии. Крысы контрольной группы получали внутрибрюшинно инъекции физиологического раствора по такой же схеме. Численность животных в каждой группе составляла 10 особей.
Установлено (табл. 1), что все регуляторные пептиды при внутрибрюшинном введении, предшествующем гипобарической гипоксии, способны значительно увеличивать резистентность животных к гипоксии - время до потери дыхания с 72 с (контроль) возрастало до 149-188 с (вилон, пинеалон, эпиталон); везуген был наименее эффективен (88 с). В то же время для него, как и для эпиталона, обнаружено наиболее быстрое восстановление позы после снятия гипоксического воздействия - оно находилось на уровне контрольных значений. Для вилона и пинеалона эта величина была несколько выше, что соответствовало более длительному времени, в течение которого животные сохраняли дыхание при гипоксии. Общее время реституции в случае вилона и пинеалона возрастало относительно контроля, а у везугена и эпиталона оставалось на уровне контроля. Соответственно наилучший коэффициент
419
9*
Таблица 1. Влияние регуляторных пептидов на физиологические характеристики крыс, перенесших воздействие острой гипобарической гипоксии
Исследуемое соединение Время до потери дыхания, с Время восстановления позы, с Время реституции, с Коэффициент реституции (3/1) Смертность, %
Контроль 72 ± 10 126 ± 21 202 ± 32 2.8 10
Вилон 149 ± 47 (p < 0.08) 152 ± 31 302 ± 50 (p < 0.08) 2.0 20
Везуген 88 ± 9 111 ± 16 194 ± 24 2.2 10
Пинеалон 184 ± 30 (p < 0.014) 152 ± 16 291 ± 35 (p < 0.1) 1.6 10
Эпиталон 150 ± 38 (p < 0.08) 103 ± 28 185 ± 33 1.2 20
Примечание. Критерий достоверности указан относительно контрольной группы животных, получавших инъекции физиологического раствора.
реституции обнаруживался для пинеалона и эпи-талона, хотя последний характеризовался и большей смертностью животных (табл. 1). По совокупности признаков пинеалон можно признать наиболее эффективным протектором, обеспечивающим наилучшую адаптацию крыс к гипокси-ческому воздействию. Поэтому в следующей серии экспериментов мы использовали пинеалон для исследования его эффекта в условиях прена-тальной гипобарической гипоксии.
В этих опытах самки крыс были подвергнуты гипобарической гипоксии на 10-й день беременности - в срок, при котором у потомства происходит закладка нервной системы [7]. Острую гипо-барическую гипоксию инициировали, как описано выше, после чего половине животных вводили пинеалон (5 внутрибрюшинных инъекций через день в дозе 10 мкг/кг массы тела), другая группа животных, служившая контролем, получала вну-трибрюшинно по такой же схеме физиологический раствор. Оценивали количество животных в потомстве, их физиологическое поведение, а также устойчивость изолированных нейронов мозжечка к окислительному стрессу.
Численность потомства от животных, перенесших гипоксию, составляла 9 ±3 особи, а в группе, получавшей пинеалон - 14 ± 2 (р < 0.05), что приближалось к нормальному физиологическому уровню, типичному для интактных животных. На 12-й день часть подросших животных была декапитирована, и их мозжечок был использован для цитометрического анализа. Оставшихся животных в возрасте 4 недель использовали для оценки их поведения в тесте "открытое поле".
Суспензию гранулярных клеток мозжечка получали, как описано ранее [8, 9], и индуцировали окислительный стресс, инкубируя клетки с пер-оксидом водорода или лигандом глутаматных рецепторов КМБА-класса, КМБА (К-метил-О-ас-партатом). Уровень активных форм кислорода (АФК) и гибель нейронов определяли с помощью
внутриклеточных зондов карбоксиметокси-2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетата (CDCF-DA, 100 мкМ) и иодистого пропидия (PI, 5 мкМ), используя проточный цитометр EPICS XL фирмы "Beckman Coulter" (США).
Инкубация нейронов с пероксидом водорода (20 мМ в течение 20 мин) или с NMDA (1 мМ в течение 40 мин) вызывала резкое возрастание гибели нейрональных клеток (рис. 1а, б). При этом в суспензии нейронов, полученных от животных, рожденных от гипоксических самок и не леченных пинеалоном, наблюдалось двукратное увеличение гибели клеток, вызываемое пероксидом водорода, в то время как для нейронов, полученных из потомства от леченых самок, эта величина не превышала 40%. Исходный уровень мертвых нейронов в первичной культуре также был почти вдвое ниже в случае нейронов, выделенных из мозжечка животных, полученных от леченных пинеалоном крыс. Таким образом, клетки, выделенные из мозжечка животных, рожденных от крыс, получавших пинеалон, обладают большей устойчивостью к окислительному стрессу.
При исследовании уровня АФК в тестируемых клетках обнаружено, что гипоксия приводит к резкому (почти в 3 раза) увеличению исходного (стационарного) уровня АФК. На этом фоне индукция окислительного стресса у нейронов с помощью неспецифического фактора (пероксида водорода) вызывает прирост свободных радикалов, который мало отличается для гипоксических животных обеих групп (получавших и не получавших пинеалон). В то же время по реакции на NMDA нейроны этих животных существенно различались. На фоне высокого стационарного уровня АФК NMDA не вызывал дополнительного роста свободных радикалов в нейронах потомства гипоксических крыс, как это наблюдается в случае интактных нейронов [7], а в нейронах потомства гипоксических крыс, леченых пинеалоном, даже понижал их рост (рис. 2). Этот факт показывает, что пинеалон защищает нейрональ-
РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ ЗАЩИЩАЮТ НЕЙРОНЫ МОЗГА
421
Р1, 16
14
12
10
8 6 4 2 0
%
Гипоксия
Гипоксия+пинеалон
Р1, % 12
10 8 6 4 2 0
Гипоксия Гипоксия+пинеалон
Рис. 1. Доля мертвых клеток в первичной культуре нейронов мозжечка крыс при инкубации с пероксидом водорода (а) или с КМБЛ (б). Инкубация с 20 мМ пероксида водорода - 20 мин, с 1 мМ КМБЛ - 40 мин.
БСГ, % 90 г
80 70 60 50 40 30 20 10 0
(а)
Гипоксия
Гипоксия+пинеалон
БСГ, % 35
30
25
20
15
10
5
0
(б)
Гипоксия
Гипоксия+пинеалон
Рис. 2. Уровень активных форм кислорода в первичной культуре нейронов при инкубации с пероксидом водорода (а) или КМЙЛ (б). Условия, как на рис. 1.
ные клетки от экзайтотоксического действия КМБЛ.
Поскольку не было обнаружено аналогии между уровнем смертности нейронов и ростом АФК при индукции окислительного стресса, можно заключить, что защита клеток от гибели осуществляется пинеалоном не путем прямого ограничения продукции АФК, а иным механизмом, возможно, связанным с повышением устойчивости мембран, как это наблюдалось нами ранее в модельных экспериментах с осмотическим гемолизом эритроцитов, индуцируемым в присутствии пинеалона. Нельзя исключить, что эффект пинеалона реализуется через увеличение устойчивости внутренней системы антиоксидантных ферментов, как это показано для других биорегуляторов [4, 5].
В возрасте 4 недель подопытные животные были подвергнуты тестированию в "открытом
поле". При этом регистрировали горизонтальную активность животных (ГА) - количество пересеченных квадратов за фиксированное время (3 мин), вертикальную активность (ВА) - количество стоек; количество обследованных норок, характеризующее исследовательскую активность животных; числ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.