научная статья по теме РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФОЛИПАЗЫ D В ПРОРОСТКАХ ОВСА СВЕТОМ И ФИТОГОРМОНАМИ Биология

Текст научной статьи на тему «РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФОЛИПАЗЫ D В ПРОРОСТКАХ ОВСА СВЕТОМ И ФИТОГОРМОНАМИ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 6, с. 855-859

УДК 581.1

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФОЛИПАЗЫ D В ПРОРОСТКАХ ОВСА СВЕТОМ И ФИТОГОРМОНАМИ

© 2004 г. Е. М. Кабачевская, Г. В. Ляхнович, И. Д. Волотовский

Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Белоруссии, Минск

Поступила в редакцию 05.03.2004 г.

Исследовали действие синтетических аналогов фитогормонов и красного света, поглощаемого фи-тохромом, на активность фосфолипазы D (ФлБ) в проростках овса (Avena sativa L.). АБК оказывала кратковременный стимулирующий эффект на активность ФлD в зеленых проростках и подавляла фосфолипазную активность в этиолированных растениях. Кинетин ингибировал активность фермента в этиолированных проростках и не влиял на его активность на свету. ГК не оказывала заметного действия на активность ФлD в этиолированных растениях и активировала фермент в зеленых проростках. Наконец, ИУК не оказывала влияния на активность фермента. Обсуждается возможность взаимосвязи регуляторного действия фитогормонов и света на активность ФлD.

Avena sativa - фосфолипаза D - фитогормоны - красный свет

Обычно процесс сигнальной трансдукции в клетке упрощенно рассматривается как линейная цепь последовательных событий, начинающаяся от взаимодействия внешнего фактора с рецептором и заканчивающаяся собственно биологическим эффектом. Упрощенно принято считать, что в клетке трансдукция реализуется по принципу один сигнал (физической или химической природы) - одна сигнальная цепь. Именно по этой схеме рассматривается трансдукция действия фитогормонов, например, ауксинов, гиббереллинов и ци-токининов на растения. Однако в реальности между различными сигнальными цепями существует сложная система взаимодействий, позволяющая организму реагировать на многочисленные изменения условий внутренней и внешней среды и обеспечивать тонкую подстройку клеточного гомеостаза к этим изменениям [1]. В качестве примера можно привести трансдукцию фитогор-монального и светового сигналов. При исследовании функций многих классов фитогормонов показано их влияние на протекание фотоморфоге-нетических реакций. Например, перенос в темноту растущих на свету растений Ьвшна gibba и Arabidopsis приводит к значительному увеличению эндогенной концентрации абсцизовой кислоты, обусловленному снятием ингибирующего

Сокращения: Кин - кинетин, КС - красный свет, ФлБ -фосфолипаза Б, ФЭт - фосфатидилэтанол. Адрес для корреспонденции: Кабачевская Елена Михайловна. Беларусь, 220072 Минск, ул. Академическая, 27. Институт биофизики и клеточной инженерии НАНБ. Факс: 375172-842359; электронная почта: lpcp@biobel.bas-net.by

контроля фоторецептора красного света (КС) фитохрома на содержание фитогормона в клетке [2]. Фитохром также контролирует активность фосфолипазы D (ФлD) [3]. В свою очередь ФлD участвует в АБК-сигнализации в растительной клетке [4, 5]. Принимая во внимание то обстоятельство, что метаболизм АБК и активность ФлD регулируются светом, представляется целесообразным проверить возможность взаимодействия между указанными системами. Кроме того, практически не изученным остается влияние на активность ФлD других фитогормонов, действие которых связано с активностью фитохромной системы [6]. В связи с этим в настоящей работе исследовали действие ИУК, ГК и цитокинина на процесс фоторегуляции ФлD.

МЕТОДИКА

В работе использовали 4-дневные проростки овса (Avena sativa L.) сорта Буг, выращенные при температуре 25°С на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой. Проростки выращивали в темноте, либо на свету в люминоста-те с лампами дневного света (освещенность на уровне растений составляла 20 Вт/м2, световой период - 12 ч).

Изучение влияния АБК и КС на активность ФлD в этиолированных проростках in vivo проводили с помощью радиоизотопного метода. Введение радиоактивной метки в мембранные липиды проростков овса осуществляли путем их инкубирования (150 мг) в течение 24 ч в 100 мкл раствора, содержащего 0.5 МБк неорганического ортофо-сфата 32P¡. Для оценки фосфолипазной активности

использовали реакцию трансфосфатидилирова-ния - катализируемый ФлБ перенос фосфати-дильной группы от молекулы фосфолипида к первичному спирту этанолу с образованием фос-фатидилэтанола (ФЭт) [7]. Реакцию трансфосфа-тидилирования запускали добавлением 1%-ного раствора этанола к предварительно нагруженным радиактивной меткой проросткам овса. Одновременно с этанолом к проросткам добавляли АБК, после чего проводили инкубацию в течение 1 ч. Часть проростков подвергали облучению КС (к = 660 нм, 9 Вт/м2). Реакцию останавливали добавлением к проросткам 600 мкл смеси хлороформ : метанол : HCl (100 : 100 : 1, по объему) и замораживанием образцов в жидком азоте. Экстракцию липидов из растительной ткани проводили по методу Bligh и Dyer [8].

Экстракты липидов высушивали под струей аргона. Качественный анализ липидного экстракта проводили при помощи метода тонкослойной хроматографии. Для этого липиды растворяли в смеси хлороформ : метанол (9 : 1, по объему) и образцы наносили на хроматографические пластины Kieselgel 60 ("Merck", Германия) с толщиной слоя силикагеля 0.25 мм. Разделение липидов проводили в нижней органической фазе смеси этилацетат : изо-октан : уксусная кислота : вода (13 : 2 : 3 : 10, по объему). В этой фазе хорошо разделялись ФЭт и фосфатидная кислота. Все остальные липиды оставались на старте. Идентификацию липидных пятен проводили в парах йода путем сравнения с маркерными липидами. Радиоактивность липидного материала в выявленных пятнах определяли с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика ("Wallac", Финляндия). Для этого пятна соскабливали и переносили во флаконы со сцинтилляционным коктейлем. Количество образовавшегося [32Р]ФЭт служило мерой активности ФлD в проростках овса in vivo.

Измерение активности ФлD in vitro проводили двумя способами: хроматографически с применением реактива Васьковского и флуориметрически.

Для первого способа измельченные проростки овса (10 г) гомогенизировали в фарфоровой ступке в 10 мл 0.1 М ацетатного буфера (pH 5.6), содержащего 40 мМ Са02 и 8% сахарозы [5]. Затем гомогенат фильтровали через капроновую мелкоячеистую ткань и полученные фильтраты центрифугировали при 3000 g в течение 20 мин. Осадок отбрасывали, а супернатанты использовали для измерений, для чего концентрацию белка в них доводили до 3.6 мг/мл. Все операции с этиолированными проростками проводили на слабом зеленом свету. Для оценки ферментативной активности в полученных препаратах использовали катализируемую ФлD реакцию трансфосфатидилирования, описанную выше. Реакцию трансфосфатидилирования в данном случае осуществляли следующим

образом: к раствору, содержащему 2 мг ФХ (ФГ, ФЭ) в 250 мкл смеси диэтиловый эфир : этиловый спирт (4 : 1), добавляли 750 мкл исследуемого гомогената и реакционную смесь встряхивали при температуре 25°C. Реакцию останавливали добавлением 400 мкл 0.2 M ЭДТА. После удаления эфира из смеси продувкой аргоном фос-фолипиды экстрагировали 1.5 мл смеси хлороформ : метанол (2 : 1, по объему). Нижний хлоро-формсодержащий слой отбирали, растворитель упаривали, остаток растворяли в 50 мкл хлороформа и наносили на хроматографические пластины (10 х 10 см) Kieselgel 60 ("Merck", Германия) с толщиной слоя силикагеля 0.25 мм. Хромато-графическое разделение проводили в системе растворителей хлороформ : метанол: 28%-ный водный аммиак (13 : 5 : 1, по объему). После высушивания пластины пятна на хроматограмме детектировали с помощью реагента Васьковского. Пятна соскабливали, определяли в них содержание фосфора и оценивали ферментативную активность по методу, описанному в работе [9].

Флуориметрический метод определения активности ФлБ использовали в опытах с ИУК, ки-нетином (Кин) и ГК. Для этого пользовались набором "Amplex Red phospholipase D Assay Kit" ("Molecular Probes") с флуоресцентным зондом для определения активности ФлD. Все операции проводили в соответствии с протоколом, приложенным к набору. Активность ФлD измеряли в фермент-сопряженной реакции, при использовании в качестве зонда 10-ацетил-3,7-дигидрофе-ноксазина (Амплекс-красный). Сначала ФлD расщепляла фосфатидилхолин до холина и фосфа-тидной кислоты. Далее холин окислялся холиноксидазой до бетаина и перекиси водорода. В итоге перекись водорода в присутствии перок-сидазы хрена взаимодействовала с Амплексом в соотношении 1 : 1 с образованием флуоресцирующего продукта резоруфина, по количеству которого и оценивали активность ФлD. Флуоресценцию возбуждали светом с длиной волны 530 нм и измеряли при 590 нм на флуориметре "Solar".

На рисунках представлены средние арифметические из трех независимых экспериментов и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследовали влияние синтетических аналогов представителей различных классов фитогормо-нов - ИУК, Кин и ГК в концентрациях 10-6 M на активность ФлD. Как видно из рис. 1, ИУК не влияла на активность ФлD ни в зеленых, ни в этиолированных растениях. Кин ингибировал активность фермента в этиолированных растениях, в то время как ГК активировал ФлD в зеленых проростках.

0

Контроль ИУК

ГК

Кин

и

о

К

т о

Q

л

О

ь

в

о н

я

и т

м <

2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8

Рис. 1. Влияние ИУК (10-6 М), ГК (10-6 М) и кинетина (Кин) (10-6 М) на активность ФлБ в зеленых (а) и этиолированных (б) проростках овса. Активность фермента определяли флуориметричес-ким методом.

Участие АБК в фотомодуляции активности ФлБ исследовали более детально, так как роль этого фитогормона в регуляции активности ФлБ была убедительно продемонстрирована на многих растительных системах [3, 4, 10, 11]. На рис. 2 представлена зависимость активности ФлБ в го-могенатах зеленых проростков овса от концентрации АБК. Как видно из рисунка, в ответ на добавление фитогормона активность фермента значительно изменялась, а концентрационная зависимость эффекта имела колоколообразную форму. Максимальный активирующий эффект наблюдали при концентрации АБК 10-5 М. В этом случае активность фермента увеличивалась в 2.4 раза.

На рис. 3 приведены временные зависимости активности ФлБ от присутствия АБК (

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком