ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 1, с. 119-126
УДК 581.14+633.11+632.4+577.114+582.288.22
РЕГУЛЯЦИЯ ХИТООЛИГОСАХАРИДАМИ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ИНФИЦИРОВАНИИ В1ро1аш sorokiniana
© 2007 г. Г. Ф. Бурханова, Л. Г. Яруллина, И. В. Максимов
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа
Поступила в редакцию 14.03.2006 г.
Изучали влияние низкомолекулярных водорастворимых производных хитина - хитоолигосахари-дов (ХОС) с мол. м. 5-10 кД и степенью ацетилирования 65% на экспрессию и молекулярную гетерогенность пероксидазы и содержание фитогормонов в растениях пшеницы (ТгШсит aestivum L.), различающихся по устойчивости к возбудителям корневой гнили (Bipolaris sorokiniana). Инфицирование растений и их обработка ХОС индуцировали экспрессию гена анионной пероксидазы и повышали активность фермента. Эти процессы зависели от степени устойчивости пшеницы; они наиболее эффективно протекали в растениях устойчивого сорта. Обработка восприимчивых растений ХОС предотвращала индуцированное патогеном снижение уровня цитокининов. Такой механизм защиты имитирует в восприимчивых к фитопатогену растениях пшеницы защитные реакции, конститутивно присущие устойчивым формам.
Triticum aestivum - Bipolaris sorokiniana - корневые гнили - анионная пероксидаза - экспрессия - хи-тоолигосахариды - устойчивость
ВВЕДЕНИЕ
Открытие иммуномодулирующей активности олигосахаридов, запускающих местные и системные защитные реакции растительных клеток, привело к значительному прогрессу в изучении механизмов устойчивости [1]. Обнаружено, что наиболее эффективными элиситорами являются полисахаридные компоненты клеточных стенок фитопатогенов, в частности, производные хитина и хитозана [2, 3]. Особый интерес при изучении механизма индуцирующего действия на иммунный потенциал растительных клеток среди них представляют водорастворимые низкомолекулярные хитоолигосахариды (ХОС). Их защитное действие проявляется в усилении синтеза фи-тоалексинов [4], повышении активности хитина-зы [1, 5], в-глюканазы [1, 6], фенилаланин-аммо-нийлиазы [1, 7] и ингибиторов протеиназ [8]. Оказалось, что ХОС также могут регулировать рост
Сокращения: АФК - активные формы кислорода; ИЭФ -изоэлектрофокусирование, ФБ - Na-фосфатный буфер, ХОС - хитоолигосахариды; RT-PCR - обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (от Reverse Transcrip-tion-Polymerase Chain Reaction).
Адрес для корреспонденции: Бурханова Гузель Фанилевна. 450054 Уфа, просп. Октября, 71. Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Электронная почта: phyto@anrb.ru
растений [2, 9] и, вполне вероятно, изменяют их гормональный баланс [10]. Так было установлено, что обработка ХОС растений \rabidopsis ^аНапа повышала экспрессию генов, кодирующих PR-(pathоgenesis-related) белки, с одновременной репрессией ауксин-индуцируемых генов [3]. Кроме этого ХОС могут влиять на образование активных форм кислорода (АФК), в частности, перекиси водорода [11]. Например, на проростках пшеницы было показано индуцирование ХОС активности оксалатоксидазы - одного из ферментов, участвующего в образовании Н2О2 [12].
Важнейшей каталитической системой, участвующей в индуцируемом патогенами и их элиситорами защитном ответе растений и, в частности, в регуляции уровня перекиси водорода в клетках, является пероксидаза [1, 11]. При ее участии происходит как непосредственное разложение молекул Н2О2, так и их утилизация в процессе синтеза лигнина и суберина [13]. Наиболее активно в этом участвуют пероксидазы, локализованные в клеточной стенке растений [14].
Целью данной работы явилось изучение влияния ХОС на экспрессию пероксидазы, ее молекулярную гетерогенность и содержание фитогормонов в растениях пшеницы различной устойчивости к поражению некротрофным грибом Bipolaris so-гоктапа, возбудителем корневой гнили.
МЕТОДИКА
Семена мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) восприимчивого (Жница) и устойчивого (Заря) к корневой гнили сортов, предварительно просте-рилизованные в 70% этаноле и затем промытые дистиллированной водой, замачивали (3 ч) в растворе препарата ХОС (1 мг/л). Препарат ХОС с мол. м. 5-10 кД и степенью ацетилирования 65% получали из хитина крабов ("Fluka", Австрия) согласно разработанной в лаборатории методике [10]. Семена проращивали в течение 24 ч на влажной фильтровальной бумаге, затем проростки высаживали в кюветы со стерильным речным песком, переносили на площадку с 16-часовым световым периодом и освещенностью 12-14 клк и поливали раствором Кнопа. Инфицирование десятидневных проростков проводили путем полива оснований стеблей суспензией конидий гриба B. sorokiniana (30 тыс. конидий/мл). Для анализа использовали корни проростков, зафиксированные в жидком азоте через 1, 2, 3, 6 и 9 суток после инфицирования.
Белковый экстракт для определения активности пероксидазы получали путем гомогенизации корней проростков в 0.01 М ^-фосфатном буфере, pH 6.0 (ФБ). Отношение массы навески к объему ФБ было 1 : 3. Экстракт центрифугировали 25 мин при 14 000 об./мин на центрифуге 5415 R ("Eppendorf", Германия). В супернатанте определяли активность цитоплазматической пероксида-зы. Осадок после многократной отмывки 0.01 М ФБ от цитоплазматических белков обрабатывали 1 М NaCl для выделения пероксидазы, связанной с клеточной стенкой ионной силой.
Активность пероксидазы измеряли по увеличению оптической плотности при 470 нм в реакционной смеси из 0.5 мл гвоякола, 200 мкл 0.25%-ной перекиси водорода и 2 мл 0.01 М ФБ и рассчитывали по методу Бояркина.
Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) белков проводили на приборе завода Хийу-Каллур (Эстония). Для этого использовали 7% полиакрила-мидный гель, содержащий 10% глицерина и 1.5% амфолинов (рН 3.5-10, "LKB", Швеция); анолит -0.06 М H3PO4, католит - 0.1 М NaOH. Наличие изопероксидаз в геле после ИЭФ обнаруживали с использованием 0.01% 3.3-диаминобензидина солянокислого ("Chemapol", Швеция) в присутствии 0.001% Н2О2 в 0.1 М ФБ. Гель после отмывки от не прореагировавшего субстрата подвергали сканированию с использованием сканера ColorPage-HR5 PRO ("Genius", США). Полученные изображения обрабатывали с помощью компьютерной программы Photoshop 6.0. Определение изоэлек-трических точек пероксидаз пшеницы проводили с использованием диагностических наборов белков с изоэлектрическими точками от 3.5 до 6.55 ("Amersham Biosciences", США).
Тотальную РНК из корней опытных растений выделяли с помощью гуанидинтиоционатного буфера, pH 8.0 [15]. Концентрацию РНК определяли, предварительно растворив образцы в буфере ТЕ (10 мМ Трис-HCl и 1 мМ ЭДТА), pH 8.0, при A260/A280 на спектрофотометре Smart Spec™ Plus ("Bio-Rad", Россия). Перед проведением реакций амплификации концентрации нуклеиновых кислот всех образцов выравнивались. Синтез кДНК проводили с использованием олигонуклеотидных праймеров и обратной транскриптазы M-MLV по протоколу фирмы-поставщика ("Fermentas," Литва). кДНК использовали в реакции амплификации с праймерами: F (5'-TTCGACAACAAGTACTACTTC-GA-3') и R (5'-CGGATCTCTCCCGCGCTGC-3') (рис. 1), соседствующий с простетической группой фермента и местом связывания с субстратом. Для анализа экспрессии гена температура отжига праймеров и количество циклов в экспоненциальной фазе амплификации подбирались экспериментальным путем. В качестве положительного контроля использовали реакцию амплификации гена, кодирующего конститутивно экспрессиру-ющийся ß-актин [16]. Электрофорез полученных ампликонов проводили в 1.5%-ном агарозном геле на электрофоретическом приборе S-2 N ("Хели-кон", Россия). Гели после окрашивания в 0.5%-ном растворе бромистого этидия фотодокументиро-вали на системе Gel Camera System (США) и полученные данные обрабатывали с помощью прилагающейся к ней оригинальной компьютерной программы LabWorks 4.6 ("UVP", США).
Лигнин выделяли последовательным удалением нелигниновых компонентов и последующей экстракцией полимера 25%-ным ацетилброми-дом в ледяной уксусной кислоте.
Содержание фитогормонов определяли имму-ноферментным методом (ИФА) [17]. Для построения стандартной калибровочной кривой использовали растворы конъюгата ИУК, АБК и зеатинри-бозида известных концентраций. Интенсивность хромофорного ответа исследуемых образцов определяли на приборе для иммуноферментного анализа АИФ 340/620-01 (Санкт-Петербург, Россия) при 492 нм. Для ИФА использовали полистироловые планшеты фирмы "Costar" (США).
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием программы Statistica 6.0. На гистограммах показаны средние значения из 3 биологических повторов, вертикальной чертой -их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Обнаружено, что в здоровых растениях пшеницы устойчивого сорта Заря активность пероксидазы в цитоплазматической фракции в несколько раз выше, чем в восприимчивых растени-
1. ОТСТСАААОА САОТОТАОСТ АОТААОТОАО АСТОТААОТО ТСААОАСАТО ААОСАСТСТС
60 АСТОСАОСАО ОТТОСТССТО ОТОТОСТСАО ТТСТТОТОСТ СТОССТСОТА АССООАООСО
120 СОАООТОСАА СААОТТААОС АОСААТТТСТ АТОАСТООАС ОТОССССООА ОТОТАСААСА
180 ТСОТССАОСА ОСАСОТОТТТ ТСТОССАТОА ОООААОАОСТ ОАОААТОООО ОССТСССТТС
240 ТСАООСТТСА ТТТССАТОАС ТОСТТТОТСА АТООСТОТОА ТООТТСААТС ТТОСТООАТО
300 ОТОСТОАТОО СОАОАААТТТ ОСАСТАСССА АСАТОААСТС ТОТСАОАООО ТАСОАООТСА
360 ТСОАСОСААТ СААООССОАС СТСОАОААСА ТОТОССССОО ООТООТОТСС ТОТОСТОАСО 420 480
540 СОССОТТСОА АССОАТСАОС ТССАТСОТАА АОААОТТТОС СОАТОТТООС СТСОАСАСОА
600
660
720 ССААССТОСА ОААОСТСТОС АССООСООСО АСООСААССА ОАССАССОСО СТООАСОТСА
780 ОСТССОСООА СОТОТТССАС ААССАСТАСТ АССАСААССТ ОСТОААСААО ААОООССТСС 840
900 СОСТООТОСА ОАСОТАСАОС ОАСОАСООСО АОСАОТТСТТ СТСООАСТТС ООСОСОТССА
960 ТООТОААОАТ ООООАОСАТА ССОТТОССАО СООбАТССбС С6АС6А6АТС СбСТОСААСТ
1020 ОСАОООТТСС СААТАААААА ТОАОСААСОО СОАОСАОАОС ТСАТСАТСТО СТАООТОААА
1080. ОАТОАААООО ТАОСТАООАА ОААСТАОССО АСТООТТААТ АААОСАООАО ТОАООАТТСА
1140 АТСССАООСО ССТОТОСАСТ ООТОСТАОСС АОТАОААСАС АСТОООТОТТ ТАСТТСАТСА
1200 ОСТОСТАСАТ ОАТСТАООАА ТТАААТАТАО ТСААТОАААТ ОТОТТОТТОТ ОТОТААТАТТ
Рис. 1. Положение праймеров 1F и 1Я на нуклеотидной последовательности гена анионной пероксидазы пшеницы ТС151917 [ht
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.