ОНТОГЕНЕЗ, 2009, том 40, № б, с. 403-418
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЭМБРИОЛОГИЯ
УДК 57.017.6;57.085.23;57.032;616-006.2.04
РЕГУЛЯЦИЯ in vitro И in vivo ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ, ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ГЕРМИНАТИВНЫХ И ТЕРАТОКАРЦИНОМНЫХ КЛЕТОК МЫШИ СИГНАЛЬНЫМИ ФАКТОРАМИ СЕМЕЙСТВА TGFß1
© 2009 г. О. Ф. Гордеева, Т. М. Никонова, Н. В. Лифанцева
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: olgagordeeva@yandex.ru Поступила в редакцию 27.04.09 г.
Активность специфических сигнальных и транскрипционных факторов определяет выбор клеточной судьбы в нормальном эмбриогенезе и при опухолевой трансформации. Исследованы транскрипционные профили генов-компонентов различных ветвей сигнальных путей факторов семейства TGFß в экспериментальных моделях начальных стадий трехмерной дифференцировки эмбриональных стволовых, эмбриональных герминативных и тератокарциномных клеток in vitro, а также в тератомах и тератокарциномах, развившихся после трансплантации в организм иммунодефицит-ных мышей Nude. Проведенный анализ показал, что в исследованных клеточных системах паттерны экспрессии генов ActivinA, Nodal, Lefty 1, Lefty2, Tgfß1, Bmp4 и GDF3 идентичны для плюрипотент-ных стволовых клеток, в то время как в клетках тератокарциномы обнаружена мРНК всех факторов за исключением гена Inhibin ßA/ActivinA. Полученные результаты свидетельствуют, что дифференциальная активность сигнальных путей факторов семейства TGFß контролирует поддержание плюрипотентного статуса, дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки-предшественники трех зародышевых листков и внезародышевых структур, а также что нормальный паттерн экспрессии факторов семейства TGFß нарушен при опухолевом росте in vitro и in vivo клеток эмбриональной тератокарциномы.
Ключевые слова: плюрнпотентные стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки, терато-карцинома, эмбриоидное тело, тератома, TGFp, ActivinA, дифференцировка.
Плюрипотентные клетки раннего эмбриона дают начало всем типам клеток взрослого организма млекопитающих. Для изучения механизмов раннего развития были получены постоянные линии плюрипотентных стволовых клеток из внутренней клеточной массы бластоцисты млекопитающих, а также из половых клеток различных стадий развития - первичных половых клеток, гоноцитов, сперматогониев, партеногенети-чески активированных ооцитов (Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981; Matsui et al., 1992; Resnick et al., 1992; Thomson et al., 1998; Shamblott et al., 1998; Ci-belli et al., 2002; Kanatsu-Shinohara et al., 2004; Guan et al., 2006; Lin et al., 2007). Плюриптентные стволовые клетки - эмбриональные стволовые и эмбриональные герминативные клетки (ЭСК, ЭГК) - способны к неограниченному самообновлению при длительном культивировании и сохраняют способность дифференцироваться в различные типы клеток in vitro. Линии плюрипотентных
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 08-04-01307а).
стволовых клеток при условии сохранения целостности их кариотипа способны обеспечивать развитие всех клеток эмбриона после инъекции их в бластоцисту, включая линию половых клеток (Nagy et al., 1993). Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, созданные экспериментально из соматических клеток взрослого организма с помощью генетических модификаций на основе лентивирусных векторов, также имеют общие свойства с ЭСК и ЭГК (Takahashi, Yamana-ka, 2006; Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007).
Малигнизированные аналоги плюрипотентных стволовых клеток - линии клеток эмбриональной тератокарциномы - были выделены из спонтанных опухолей семенников и яичников у мыши и человека, однако биологические свойства этих линий значительно варьируют, хотя и проявляют некоторые общие черты с плюрипо-тентными клетками (см. обзор: Andrews, 2002). Существующие литературные данные указывают на то, что появление тератокарциномных клеток в гонадах является результатом нарушения
механизмов контроля специализации первичных половых клеток из плюрипотентных (Andrews, 2002; Kimura et al., 2003, Gordeeva, 2007). Хромосомные и генные мутации, которые несут тератокарци-номные клетки, определяют их способность к диф-ференцировке в различные типы клеток или полностью ограничивают все дифференцировки, как происходит в случае нуллипотентных клеточных линий (Blelloch et al., 2004).
Исследования механизмов самообновления и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток различного происхождения, различающихся по онтогенетическому и эпигенетическому статусам клеток-источников линий, свидетельствуют о том, что наряду с общими свойствами линий проявляются их различия в генной экспрессии, генетической стабильности и способности дифференцироваться в различные типы клеток (Rohwedel et al., 1996; Allegrucci, Young, 2007; Sharova et al., 2007). Было показано, что онтогенетический статус клеток-источников в меньшей степени оказывает влияние на экспрессию генов в недифференцированных и дифференцирующихся ЭСК и ЭГК, чем их принадлежность к разным генотипам линий мышей (Sharova et al., 2007). Существуют многочисленные данные о различиях в транскрипционных профилях линий ЭСК человека и мыши, которые, тем не менее, не влияют на их общие биологические свойства (Brandenberger et al., 2004; Calhoun et al., 2004; Adewumi et al., 2007; Sharova et al., 2007). В то же время, индуцированные плю-рипотентные стволовые клетки, полученные из различных соматических клеток, демонстрируют различный онкогенный потенциал, который, вероятно, зависит от генетического и эпигенетического статусов клеточных источников линий, а также может быть следствием нарушения механизмов ре-программирования (Maherali et al., 2007; Okita et al., 2007; Wernig et al., 2007; Aoi et al., 2008). Кроме того, наблюдаемая вариабельность свойств линий эмбриональной тератокарциномы указывает на то, что существуют множественные пути регуляции клеточной судьбы при канцерогенезе, которые значительно отличаются от механизмов эмбрионального развития.
Сигнальные пути факторов семейства TGFß, интегрированные в регуляторную сеть клеток, участвуют в различных процессах: в определении судьбы клеток в процессе нормального и патологического развития, а также в контроле пролиферации и клеточной гибели (Miura et al., 2008; Siegel, Massague, 2008). Семейство TGFß насчитывает 40 факторов у человека и других позвоночных, которые, несмотря на структурно-функциональное сходство, обеспечивают тонкую регуляцию клеточных процессов (Derynck, Miyazono, 2008). С другой стороны, один и тот же фактор этого семейства может участвовать в регуляции различных процессов в разных клетках. Одним словом, все факторы семейства TGFß
являются полифункциональными и контекстно-зависимыми, т.е. проявляют свои свойства в зависимости от других факторов в определенных условиях в разных типах клеток (Katagiri et al., 2008; Shilling et al., 2008; Wiater, Vale, 2008). Известно, что факторы этого семейства Nodal, Activin, Lefty, BMP, gDf, TGFß являются ключевыми регуляторами детерминации клеток трех зародышевых листков, линии половых клеток и внезародышевых структур, а также участвуют в регуляции формирования осей тела зародыша и морфогенеза различных зачатков (Bed-dington, Robertson, 1999; Vincent et al., 2003; Miura et al., 2008). Однако механизмы функционирования сигнальных систем, активирующих специфические гены-мишени, а также взаимодействия различных сигнальных путей в разных типах клеток, остаются далекими от понимания.
Цель нашей работы - изучение различных ветвей сигнальных систем семейства факторов TGFß в процессе дифференцировки ЭЖ, ЭГТС и эмбриональной тератокарциномы (ЭТЮ мыши в трехмерной бессывороточной системе культивирования и после трансплантации их в организм иммунодефи-цитных мышей линии Nude. В ходе работы на основании сравнительного анализа процессов роста и дифференцировки ЭЖ,, ЭГТС и ЭTK in vitro и in vivo, а также анализа их транскрипционных профилей, включающих гены-компоненты различных ветвей сигнальных путей факторов семейства TGFß и гены специфических внутриклеточных факторов, были выявлены общие механизмы регуляции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, которые существенно отличаются от механизмов, имеющих место в опухолевых тератокарциномных клетках.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Культивирование клеток in vitro. В работе были использованы ЭCK мыши линии R1, ЭГK мыши линии EGC-10, любезно предоставленные доктором А. Макларен (А. McLaren, WTCR Institute of Cancer and Developmental Biology, Cambridge, UK), а также ЭTK мыши, сублиния F9 (Банк клеточных культур ИНЦ РАН, епб). ЭЖ, ЭГЖ и ЭТО: культивировали в среде Knockout DMEM, содержащей 1 мМ L-глутамина, 0.1 мМ заменимых аминокислот, 0.1 мМ ß-меркаптоэтанола и 15% заменителя телячьей фетальной сыворотки (Knockout Serum Replacement, "Gibco", ешА). Недифференцированные ЭCK и ЭГТС поддерживали на фидере из первичных эмбриональных фибробластов мыши, инактивиро-ванных митомицином C (10 мкг/мл) ("Sigma", CШA). Для изучения динамики роста ЭCK, ЭГТС и ЭTK культивировали в среде с фактором ингибиро-вания лейкемии LIF, 10 нг/мл ("Sigma", CШA) или без добавления фактора. Подсчет числа клеток, выросших в среде с LIF и без него, проводили на 5-е сут культивирования. Cтaтистичeский анализ
различий проводили с использованием парного критерия Огьюдента, а достоверность гипотез о влиянии LIF оценивали с помощью метода анализа вариаций ANOVA.
Для получения стандартных эмбриоидных тел использовали метод "висячей капли": капли суспензии плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток (500 клеток в капле) помещали на крышку чашки для формирования эмбриоидных тел в течение 3 сут культивирования. Cформированые эм-бриоидные тела (ЭТ1) собирали из капель, переносили в новые чашки для суспензионного культивирования в течение последующих 5 сут (ЭТ5). Таким образом, общее время культивирования и диффе-ренцировки клеток в описанных условиях составляло 7 сут.
Получение тератом и тератокарцином in vivo. Для получения экспериментальных тератом и тератокарцином в качестве реципиентов были использо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.