БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 1, с. 142 - 149
УДК 547.9;577.15
РЕГУЛЯЦИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ Erwinia carotovora С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЭГ-ХИТОЗАНА И ГЛИКОЛЬ-ХИТОЗАНА
© 2015 К.В. Суховерков, Е.В. Кудряшова*
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва; электронная почта: helena_koudriachova@hotmail.com
Поступила в редакцию 16.06.14 После доработки 26.07.14
Для разработки препаратов L-аспарагиназы Erwinia carotovora (EwA) пролонгированного действия предложен новый подход, основанный на образовании конъюгатов фермента с разветвленными сополимерами хи-тозана, ПЭГ-хитозана и гликоль-хитозана. Оптимизация молекулярной архитектуры и состава конъюгатов приводит к увеличению каталитической эффективности фермента (kcat/KM) при физиологических условиях в 3—6 раз. Показано, что наблюдаемый эффект обусловлен главным образом сдвигом рН-профиля каталитической активности фермента в область более низких значений рН за счет поликатионной природы сополимера. Обнаружено, что конъюгирование аспарагиназы с производными хитозана приводит к повышению термостабильности фермента. Можно ожидать, что ХитоПЭГилирование, аналогично ПЭГилированию, будет эффективным для улучшения биофармацевтических свойств и снижения иммуногенности данного медицински значимого фермента. Следует отметить, что для определения состава сополимеров ПЭГ-хитоза-на и конъюгатов сополимер—фермент был использован разработанный нами новый эффективный метод, основанный на ИК-спектроскопии. Данный метод является «безреагентным», позволяет быстро и надежно получать необходимые параметры из анализа единичного ИК-спектра в отличие от используемых ранее трудоемких и недостаточно точных методов, основанных на определении свободных аминогрупп полимеров по реакции с TNBS или OPA.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: L-аспарагиназа, ИК-спектроскопия, хитозан, ПЭГ, конъюгаты, стабилизация, ВЭЖХ.
Ь-Аспарагиназа относится к классу треони-новых амидогидролаз и катализирует реакцию гидролиза аспарагина до аспарагиновой кислоты с выделением аммиака. Для опухолевых лим-фобластов аспарагин является незаменимой аминокислотой, без поступления которой нарушается синтез белков, и клетка становится неспособной к дальнейшему делению. Сниженная или полностью отсутствующая активность аспа-рагинсинтазы, синтезирующей аспарагин, является отличительной чертой лейкемических лим-фобластов, миелобластов и целого ряда других опухолевых клеток, что определяет применение Ь-аспарагиназы в терапии острого лимфобласт-ного лейкоза (ОЛЛ), лимфо- и ретикулобластом и неходжкинских лимфом высокой степени злокачественности у детей [1—4]. В последнее вре-
Принятые сокращения: ДМСО — диметилсульфок-сид, ПЭГ — полиэтиленгликоль, EwA — L-аспарагиназа Erwinia carotovora, mPEG-suc-NHS — монометоксиполи-этиленгликоль-^гидроксисукцинимидил-сукцинат.
* Адресат для корреспонденции.
мя появились сообщения об использовании ас-парагиназы для лечения острой миелобластной лейкемии, болезни Ходжкина, меланосаркомы и множественной миеломы [5, 6].
Однако использование бактериальных Ь-ас-парагиназ в терапии осложнено их неустойчивостью в кровотоке и повышенной иммуноген-ностью, ведущей к развитию побочных эффектов — от аллергических реакций до анафилактического шока [4, 5]. Частично эта проблема решается модификацией фермента полиэтилен-гликолем (ПЭГ) [7—9]. Однако длительное терапевтическое применение ферментных препаратов, в т.ч. и «ПЭГилированных» форм, сопровождается рядом побочных эффектов. В частности получившая широкое применение ПЭГи-лированная форма аспарагиназы «Онкаспар» недостаточно уменьшает вероятность развития аллергических реакций, в результате чего терапия перестает быть эффективной [10]. Таким образом, актуальной является задача разработки новых высокоэффективных аспарагиназных препаратов пролонгированного действия ново-
го поколения, обладающих низкой иммунологической активностью.
Для решения данной задачи нами предложен подход, основанный на образовании конъюгатов фермента с производными хитозана — биосовместимого, биодеградируемого полисахарида, который широко применяется в косметической и фармацевтической промышленности. Полиэлектролитная природа полимеров на основе хи-тозана обусловливает многоточечное электростатическое взаимодействие с поверхностью белка, что способствует закреплению конформации фермента, а также создает специфическое высо-когидратированное микроокружение вблизи активного центра фермента [11]. Следует также ожидать, что применение разветвленных полимеров приведет к снижению иммуногенности ферментного препарата, что может позволить снять ряд ограничений по применению бактериальных препаратов в терапии. Физико-химические и, соответственно, биологические свойства конъюгатов фермента с хитозаном можно целенаправленно варьировать в широком диапазоне в зависимости от степени полимеризации, плотности заряда на полиэлектролите и наличия заместителей (в т.ч. молекул ПЭГ) в полимерной цепи хитозана, что позволяет регулировать каталитические свойства фермента [12].
Разработка нового подхода получения ферментных форм пролонгированного действия осуществлена на примере нового рекомбинант-ного фермента L-аспарагиназы Erwinia carotovora (EwA), продуцируемого генно-инженерными штаммами Escherichia coli [13—15]. Доклинические испытания продемонстрировали высокую эффективность препарата EwA в проведенных тестах на противоопухолевую активность, гиперчувствительность и токсичность [13], что определяет перспективность разработки препарата пролонгированного действия на основе данного фермента.
Настоящая работа посвящена синтезу конъюгатов EwA с разветвленными сополимерами на основе хитозана различного состава и структуры для оптимизации каталитических свойств фермента, на основе которого может быть создан новый аспарагиназный противоопухолевый препарат с улучшенными биофармацевтическими характеристиками.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы. Препарат рекомбинантной L-ас-парагиназы (EwA) получен по ранее описанной методике [14]. Образцы хитозана (5 и 15 кДа) — препараты фирмы «Биопрогресс» (Россия), гли-
коль-хитозан (72 кДа) — фирмы «Sigma» (США), активированное производное ПЭГ — mPEG-suc-NHS (5 кДа) — любезно предоставлен Н.С. Мелик-Нубаровым (химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова) [15]. Прочие соединения: ДМСО, дигидрофосфат, моногидро-фосфат и хлорид натрия — фирмы «Sigma» (США), ледяная уксусная кислота — фирмы «Lancaster» (США).
Синтез сополимеров ПЭГ-хитозана. Синтез сополимера ПЭГ-хитозана проводился с использованием препаратов хитозана и mPEG-suc-NHS. Хитозан в концентрации 5 мг/мл был растворен в 3%-ном растворе уксусной кислоты при интенсивном перемешивании. После того как был получен прозрачный раствор, рН системы доводили до 6,5 с использованием 150 мМ натрий-фосфатного буфера. Конечная концентрация раствора хитозана составила 3 мг/мл. В полученный раствор по каплям при перемешивании вводили 1-3-кратный молярный избыток (в пересчете на моль деацилированных аминогрупп хитозана) раствора mPEG-suc-NHS в ДМСО. При проведении реакции рН раствора доводили до pH 7,5 150 мМ натрий-фосфатным буфером. Смесь интенсивно перемешивали в течение 1—3 ч. Очистку производили методом диализа против 15 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,5) в течение 2 сут при комнатной температуре. Чистота препарата контролировалась с помощью гель-фильтрации методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «Knauer» (Германия) на носителе Bio Fox 17 SEC в колонке размером 15 см х 1 см2. Элюент — натрий-фосфатный буфер (15 мМ фосфат, рН 7,5, 150 мМ NaCl), скорость элюирования 0,5 мл/мин, 25°.
Получение конъюгатов аспарагиназы с сополимерами ПЭГ-хитозана. Конъюгаты аспарагиназы с ПЭГ-хитозаном синтезировали путем модификации аминогрупп аспарагиназы по реакции восстановительного аминирования. Для этого к раствору аспарагиназы (4 мг/мл) в 15 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,5) добавляли порциями при перемешивании раствор ПЭГ-хитозана в молярном отношении к ферменту 20 : 1. Полученную смесь инкубировали при непрерывном перемешивании в течение 40 мин при 16°. Далее к реакционной смеси добавляли цианборгидрид натрия (5-кратный молярный избыток по отношению к ферменту) и инкубировали еще 40 мин при непрерывном перемешивании. После этого реакционную смесь подвергали гель-фильтрации методом ВЭЖХ на носителе BioFox 17 SEC в условиях, аналогичных описанным выше. Полученный препарат хранили при —20°.
Синтез конъюгата с гликоль-хитозаном. Для синтеза конъюгата, содержащего три цепи гли-
коль-хитозана на одну белковую глобулу, к раствору аспарагиназы в концентрации 1,7 мг/мл в 15 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,5) добавляли раствор гликоль-хитозана в концентрации 10,8 мг/мл в том же буфере. Получившуюся смесь инкубировали 40 мин при 15°. Затем к ней добавляли 5-кратный молярный избыток (по отношению к белку) цианборгидрида натрия в виде раствора в 35 мкл 15 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,5). После этого реакционную смесь инкубировали 40 мин при 15°. Реакцию останавливали при помощи замораживания.
Регистрация спектров ИК. Измерение спектров всех исследуемых образцов проводили на ИК-спектрометре Фурье Bruker Tensor 27 («Bruker», Германия), оснащенном MCT-детектором, охлаждаемым жидким азотом. Оборудование было подключено к системе продувки сухим воздухом Jun-Air. Измерения проводились в термостати-руемой ячейке нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) BioATR-II с ZnSe-крис-таллом («Bruker», Германия). В типичном эксперименте в ячейку НПВО ИК-спектрометра помещали 30 мкл раствора образца в фосфатном буфере с концентрацией 0,5—2 мг/мл. Спектры измеряли в интервале частот 4000—950 см-1 со спектральным разрешением 2 см-1. Температура измерения 22°. Для каждого спектра производилось 100-кратное сканирование и усреднение. Регистрацию фона проводили в аналогичных условиях. Результирующие спектры по необходимости спрямляли методом Савицкого-Голлая до спектрального разрешения 4 см-1. Анализ спектров проводили с помощью программы Opus 7.0.
Определение каталитической активности аспара
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.