научная статья по теме РЕГУЛЯЦИЯ КОМПЕНСАТОРНОГО СИНТЕЗА ДОФАМИНА В АРКУАТНОМ ЯДРЕ У КРЫС Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «РЕГУЛЯЦИЯ КОМПЕНСАТОРНОГО СИНТЕЗА ДОФАМИНА В АРКУАТНОМ ЯДРЕ У КРЫС»

НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 3, с. 207-217

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

УДК 577.175.82,577.175.328

РЕГУЛЯЦИЯ КОМПЕНСАТОРНОГО СИНТЕЗА ДОФАМИНА В АРКУАТНОМ ЯДРЕ У КРЫС © 2014 г. Л. К. Дильмухаметова1, Т. С. Пронина1, *, Е. В. Волина1, М. В. Угрюмов1, 2

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития

им. Н.К. Кольцова РАН, Москва Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, Москва

Дофамин, синтезирующийся нейронами аркуатного ядра, играет ключевую роль в регуляции репродуктивной функции организма, ингибируя секрецию пролактина. Нами ранее было показано, что дофамин в аркуатном ядре синтезируется не только дофаминергическими нейронами, обладающими обоими необходимыми для этого ферментами, но и совместно нейронами экспрессирую-щими только по одному комплементарному ферменту — тирозингидроксилазу или декарбоксилазу ароматических Ь-аминокислот. Целью данной работы явилась проверка оригинальной гипотезы о том, что синтез дофамина в моноферментных нейронах находится под ингибиторным контролем норадренергических афферентов. Для этого был проведен сравнительный анализ секреторной активности дофамин-синтезирующих нейронов аркуатного ядра у крыс после того, как у одних животных фармакологически была вызвана дегенерация большей части дофаминергических нейронов при сохранении норадренергической афферентации аркуатного ядра, а у других — была вызвана дегенерация такого же количества дофаминергических нейронов, но при этом разрушены норадре-нергические афференты. Полученные при этом данные свидетельствуют о том, что: (а) норадренер-гическую иннервацию в аркуатном ядре получают главным образом нейроны, содержащие только один фермент синтеза дофамина — тирозингидроксилазу, (б) норадреналин оказывает ингибирую-щее влияние на экспрессию тирозингидроксилазы в моноферментных нейронах и на первый этап синтеза дофамина, т.е. превращение Ь-тирозина в Ь-диоксифенилаланин, в этих нейронах.

Ключевые слова: аркуатное ядро, дофамин, норадреналин, 6-гидроксидофамин, десметилимипрамин, иммуногистохимия, высокоэффективная жидкостная хроматография.

Б01: 10.7868/81027813314030030

ВВЕДЕНИЕ

Дофамин, синтезирующийся в дофаминергических нейронах аркуатного ядра и выделяющийся из их аксонов в срединном возвышении в гипо-физарный портальный кровоток, играет важную роль в регуляции репродуктивной функции организма, ингибируя секрецию пролактина [1]. Однако в наших предыдущих исследованиях было показано, что дофамин в аркуатном ядре синтезируется не только в дофаминергических нейронах, содержащих оба фермента синтеза дофамина — тирозингидроксилазу и декарбоксилазу ароматических Ь-аминокислот, но и тандемами недофами-нергических нейронов, содержащих по одному из комплементарных ферментов синтеза дофамина. При этом в моноферментных нейронах, содержащих тирозингидроксилазу, из Ь-тирозина синте-

* Адресат для корреспонденции: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26; тел./факс: (499)135-88-42; e-mail: tatiana.pronina @mail.ru.

зируется Ь-диоксифенилаланин (Ь-ДОФА), который выделяется из этих нейронов и захватывается в моноферментные нейроны, содержащие только декарбоксилазу ароматических Ь-амино-кислот, где и происходит синтез дофамина [2]. Биферментные нейроны и моноферментные нейроны, содержащие декарбоксилазу ароматических Ь-аминокислот, располагаются преимущественно в дорсомедиальной области аркуатного ядра, а моноферментные нейроны, содержащие тирозингидроксилазу — ключевой фермент синтеза дофамина, в вентролатеральной области [3].

Дофамин-синтезирующие нейроны аркуатного ядра, дофаминергические нейроны и/или моноферментные нейроны, находятся под эндокринным и нервнопроводниковым контролем, в частности, со стороны моноаминергических нейронов [1, 4]. Так, предполагается, что в регуляции дофамин-синтезирующих нейронов участвует норадреналин. Об этом свидетельствует, с одной стороны, то, что аркуатное ядро иннервируется

норадренергическими аксонами [5], а, с другой то, что норадреналин оказывает непрямое стимулирующее влияние на выделение пролактина, как считается, опосредованно через нейроны аркуат-ного ядра [4]. Предположение об участие норад-реналина в регуляции дофамин-синтезирующих нейронов косвенно подтверждается и результатами наших предыдущих исследований. Действительно, было показано, что при дегенерации большей части дофаминергических нейронов ар-куатного ядра под влиянием специфического нейротоксина — 6-гидроксидофамина (6-ГДА), включается компенсаторный синтез дофамина, однако только при одновременном фармакологическом выключении норадренергических аффе-рентов. Это приводит к восстановлению дофаминового ингибиторного контроля лактотрофов гипофиза и к снижению уровня секреции пролактина до нормы [6, 7]. Важно подчеркнуть, что компенсаторный синтез дофамина на фоне дегенерации большинства дофаминергических нейронов и снижение уровня секреции пролактина до нормы был обнаружен у крыс только в хроническом эксперименте — через 45 дней после действия нейротоксина, тогда как через 14 дней никаких признаков компенсации не наблюдалось.

Приведенные косвенные показатели участия норадреналина в регуляции дофамин-синтезиру-ющих нейронов не позволяют ответить на следующие принципиально важные вопросы, какие именно нейроны являются мишенью для норадреналина — дофаминергические (биферментные) или моноферментные, содержащие тирозингид-роксилазу или декарбоксилазу ароматических L-аминокислот и оказывает ли норадреналин влияние на синтез и/или выделение дофамина. Получение ответа на эти вопросы и явилось целью данной работы. Для этого предполагалось провести сравнительный анализ содержания в нейронах тирозингидроксилазы — скорость лимитирующего фермента синтеза дофамина, а также выделения и синтеза дофамина у крыс с фармакологически вызванной дегенерацией большей части дофаминергических нейронов и у крыс с фармакологически вызванной дегенерацией большей части дофаминергических нейронов и норадренегрических аксонов через 45 дней после фармакологического воздействия на фоне ярко выраженного компенсаторного усиления синтеза дофамина.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные, эксперименты. Работу проводили на самцах крыс линии Вистар весом 220—240 г. В 1-й группе 12-ти животным внутрибрюшинно вводили 0.5 мл 0.9% NaCl, во 2-й группе 12-ти животным вводили по 25 мг/кг веса в 0.5 мл 0.9% NaCl десметилимипрамина (ДМИ) (Sigma,

США), ингибитора мембранного переносчика норадреналина. Через 40 минут каждому животному в обеих группах стереотаксически в боковой желудочек мозга (координаты от брегмы: ка-удально — 0.8 мм, латерально — 1.5 мм, 3.2 мм от поверхности мозга) [8] вводили по 250 мкг 6-ГДА (Sigma, США) в 15 мкл 0.9% NaCl с 0.1% аскорбиновой кислотой со скоростью 3 мкл/мин. В качестве контроля использовали интактных животных (12 самцов). Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде и 12-ти часовом режиме день—ночь. Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с национальными и международными требованиями и правилами, и утверждены комитетом по охране животных Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Получение материала для исследований. Для физиологических исследований использовали материал от интактных животных, которые служили контролем, и животных на 45-й день после введения одним — 6-ГДА, а другим — ДМИ с 6-ГДА. В каждой группе было по 8 животных. Крыс под наркозом пентобарбиталом натрия де-капитировали и выделяли мозг. Далее на вибрато-ме (Vibratome 1000 plus Sectioning system, Германия) в растворе Кребса—Рингера, содержащем (мМ): NaCl 120, KCl 4.8, CaCl2 2, MgSO4 1.3, NaHCO3 25, d-глюкозу 10, HEPES 20, аскорбиновую кислоту 0.1 (pH 7.4, +4°C), приготавливали 4 фронтальных среза мозга толщиной по 300 мкм с координатами от —2.4 мм до —3.6 мм каудальнее брегмы, после чего под контролем бинокулярной лупы при +4°C вырезали медиобазальный гипоталамус (рис. 1). Вибратомные срезы помещали в термостатируемые (+37°С) проточные камеры объемом 400 мкл и инкубировали в растворе Кребса—Рингера в течение 40 мин при скорости потока раствора через камеру 100 мкл/мин. После этого собирали 6 последовательных 10-минутных фракций инкубационной среды, оттекавшей из камер. Далее в камеры поступал раствор Кребса-Рингера с повышенным содержанием К+, содержащий (мМ): NaCl 68, KCl 55.5, CaCl2 2, MgSO4 1.3, NaHCO3 25, d-глюкозу 10, HEPES 20, аскорбиновую кислоту 0.1 (pH 7.4). После этого собирали еще 6 последовательных 10-минутных фракций инкубационной среды. В собранные фракции среды добавляли по 100 мкл 1 М HClO4 и по 1 нг 3,4-дигидроксибензиламина в качестве внутреннего стандарта, необходимого для дальнейшей высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией. После окончания инкубации ткань медиобазального гипоталамуса взвешивали и замораживали в жидком азоте. Фракции инкубационной среды также замораживали и вместе с тканью хранили при

—70° C до определения в них катехоламинов и их метаболитов.

Для морфологического исследования использовали по 4 животных из каждой эксприменталь-ной группы — на 45-й день после введения только 6-ГДА или 6-ГДА с ДМИ, а также 4 интактных животных (контроль). Крыс под наркозом перфу-зировали через сердце сначала 0.02 M фосфатным буфером с 0.9% NaCl (фосфатно-солевым буфером) в течение 10 мин., а затем охлажденным до 4°С 4% параформальдегидом на 0.2 М фосфатном буфере в течение 10 мин. После этого вычленяли мозг, дофиксировали его иммерсией 12 ч в 4% па-раформальдегиде при +4°С, инкубировали в 20% растворе сахарозы в течение 24 ч при 4°С, замораживали в изопентане при —40°С и хранили при —70°С.

Обработка и анализ полученных образцов. Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией. В собранных фракциях и в срезах медиобазального гипоталамуса определяли содержание норадреналина, дофамина, L-ДОФА и дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) методом ВЭЖХ с электрохимической детекцией. Ткань гомогенизировали с помощью ультразвукового гомогени

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Медицина и здравоохранение»