МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 2, с. 166-172
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 546.22.577.552.846.2
РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПУТЕЙ У БАКТЕРИЙ РОДА SULFOBACILLUS ПРИ ИЗМЕНЕНИИ СТЕПЕНИ АЭРАЦИИ СРЕДЫ
© 2010 г. Е. Н. Красильникова*, Л. М. Захарчук*, 1, М. А. Егорова*, Т. И. Богданова**,
А. Е. Журавлева**, И. А. Цаплина**2
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра микробиологии **Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
Поступила в редакцию 26.03.2009 г.
Проведено сравнение активности ферментов углеродного метаболизма умеренно термофильных хемолитотрофных бактерий Sulfobacillus sibiricus, штаммов N1 и SSO, и S. thermosulfidooxidans subsp. asporogenes 41, выращенных без принудительной аэрации, в высоком слое среды, с активностью ферментов тех же культур, выращенных при интенсивной аэрации. Снижение доступа воздуха к растущим клеткам S. sibiricus N1 приводило к переключению метаболизма глюкозы с пентозофос-фатного на путь Энтнера—Дудорова при сохранении пути Эмбдена—Мейергофа—Парнаса. У штамма SSO S. sibiricus и штамма 41 S. thermosulfidooxidans subsp. asporogenes, независимо от кислородного режима культивирования, расщепление глюкозы осуществлялось по путям Энтнера—Дудорова и пентозофосфатному соответственно, а также по пути Эмбдена—Мейергофа—Парнаса. Продолжительный рост S. sibiricus, N1 и SSO, в высоком слое среды, без принудительной аэрации приводил к репрессии синтеза большинства ферментов ЦТК, особенно дегидрогеназ, и ряда карбоксилаз, в том числе РБФ-карбоксилазы. Обсуждаются особенности углеродного метаболизма у различных штамов сульфобацилл при росте в условиях дефицита кислорода.
Ключевые слова: термоацидофильные сульфобациллы, условия аэрации, ферменты углеводного обмена, ЦТК, карбоксилазы.
Для сохранения возможности существования при изменении условий микроорганизм должен либо изменить среду, либо сам адаптироваться к ее изменениям. Адаптация организма к изменяющимся условиям представляет собой сложный процесс, протекающий как на генотипическом, так и на фе-нотипическом уровнях. Результат такого приспособления на фенотипическом уровне чаще всего выражается в изменении процессов метаболизма и типов питания. В результате физиолого-биохими-ческих исследований многочисленных представителей сероокисляющих бесцветных бактерий сформировались представления о большом разнообразии метаболических возможностей не только среди различных таксономических и физиологических групп этих бактерий, но в пределах отдельных групп и на уровне отдельных видов и штаммов [1—3].
Одной из физиологических групп бактерий, обитающих в постоянно меняющихся условиях среды, являются термофильные хемолитотрофные серо- и железоокисляющие бактерии рода Sulfobacillus [4]. Обитая в местах разрабатываемых месторождений сульфидных руд, в очагах термогенеза, при биовыщелачивании сульфидных руд и концентратов руд, эти бактерии подвергаются стрессовым
1,2 Адресат для корреспонденции (e-mail: zakharchuk@mail.ru и
tsaplina_inmi@mail.ru).
воздействиям, одним из которых является постоянное изменение в среде концентраций кислорода, растворимость которого резко снижается при повышении температуры, особенно в кислых средах, обогащенных ионами металлов. Вместе с тем известно, что сульфобациллы, являясь факультативными анаэробами, могут расти при низких концентрациях кислорода или в его отсутствие [5—7]. Нами ранее было показано, что бактерии рода 8и1-/оЬасШш, отличаясь широким спектром ферментов углеродного обмена, способны быстро перестраивать свой метаболизм в ответ на изменения условий питания и физико-химических факторов — высоких концентраций ионов металлов, низких и высоких температур, сверхнизких значений рН среды и др. [8-12].
О перестройках реакций метаболизма в клетках сульфобацилл, пребывающих в условиях лимита по кислороду, литературные данные отсутствуют, тогда как скорость перестройки метаболических путей имеет большое значение для адаптации организмов к изменениям условий среды.
В предыдущем исследовании было показано, что в условиях дефицита кислорода при культивировании в высоком слое среды при парциальном давлении воздуха увеличиваются время генерации клеток сульфобацилл, продолжительность роста куль-
тур, уменьшается клеточный урожаи, в ростовой среде появляются экзометаболиты — ацетат и про-пионат, образуются покоящиеся формы, фаза окисления железа сменяется фазой его восстановления. В условиях гипоксии при содержании кислорода в газовой фазе, равном 0.07%, процессы окисления субстратов сопряжены с восстановлением окисного железа в качестве конечного акцептора электронов [13].
Цель данной работы — выяснение воздействия степени аэрации ростовой среды на активность ферментов углеродного метаболизма хемолито-трофных умеренно термофильных бактерий Sulfo-bacШus sibiricus и S. thermosulfidooxidans 8иЪ8р. asporo-genes.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты работы. В качестве объектов исследования были взяты три умеренно термофильных штамма ацидофильных бактерий рода Sulfobacillus. Две культуры принадлежали к виду S. sibiricus, штамм N1T (ВКМ В-2380т = DSM 17363T) и штамм SSO, и одна — к S. thermosulfidooxidans subsp. asporogenes 41 (ИНМИ Армении В-6981Т). Штаммы были выделены из различных местообитаний [11, 14—16].
Культивирование. Штаммы N1, SSO, 41 выращивали на средах, указанных ранее, в миксотрофных
условиях на среде с Fe(II), S2o3 , глюкозой и дрожжевым экстрактом [13]. Значение рН сред 1.6—1.8; температура культивирования 55°С. Для получения посевного материала все штаммы выращивали на качалке (180 об/мин) в колбах емкостью 250 мл в 100 мл среды при соотношении объемов Уколбы : Усреды = = 2.5 : 1. Для постановки ряда экспериментов со штаммом S. sibiricus N1 при парциальном давлении воздуха (21% кислорода в воздушной фазе) культуру в течение 10 пассажей выращивали на среде с закис-ным железом в статических условиях в высоком слое среды при соотношении Уколбы : Усреды = 1.4 : 1.
Дальнейшее культивирование выросших в колбах бактерий осуществляли без принудительной аэрации, при парциальном давлении кислорода воздуха в бутылях при соотношении Убугыли : Усреды = = 1.2—1.4 : 1. Условия интенсивной аэрации, которая достигалась продуванием 1 объема воздуха/ 1 объем среды в 1 мин, в 5-литровых бутылях при
соотношении Убугыли : Усреды = 1.7 : 1, являлись контрольными.
Методы анализа. Клеточные суспензии культур из ростовой фазы для последующего определения активности ферментов углеродного метаболизма получали путем центрифугирования в течение 40 мин при 10000 g и 4°С [12]. Осадок отмывали подкисленной средой без источника энергии. Затем клетки суспендировали в 0.1 н трис-НС1 буфере, рН 6.8, разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т в течение 3 мин с пере-
рывами 5—6 мин для охлаждения, центрифугировали в течение 30 мин при 40000 g и 4°С. Активность ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), углеводного обмена и карбоксилаз определяли в супернатанте с помощью спектрофотометра Hitachi 200-20 и радиометрическим методом [8]. Белок определяли по Лоури с соавт. [17].
Все опыты проводили в 3—5-кратной повторно-сти, в том числе аналитические определения. Обсуждаются статистически достоверные различия приp < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Ферменты углеводного метаболизма. Выращивание S. sibiricus N1 при атмосферном парциальном давлении кислорода в миксотрофных условиях на среде с железом существенно отразилось на путях метаболизма глюкозы (табл. 1). Уже в первом пассаже в клетках, растущих в таких условиях, значительно снижалась активность гексо-киназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфофруктокиназы, 6-фосфоглюконатдегидро-геназы, дегидрогеназы 3-фосфоглицеринового альдегида и пируваткиназы по сравнению с активностью этих ферментов у бактерий, выросших при активной аэрации. Проявлялась высокая активность ключевых ферментов пути Энтнера—Ду-дорова — 6-фосфоглюконатдегидратазы и 2-кето-З-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы. Дальнейшее поддержание штамма N1 в условиях затрудненного доступа воздуха (XI пересев) приводило к уменьшению активности большинства ферментов, в том числе активности фруктозобисфосфатальдолазы.
Данные по активности ферментов свидетельствовали о том, что в оптимальных для роста бактерии S. sibiricus N1 условиях, т.е. при интенсивной аэрации среды, использование глюкозы осуществляется по окислительному пентозофосфатному пути и пути Эмбдена—Мейергофа—Парнаса [10]. Существенное снижение доступа кислорода воздуха к растущей культуре приводит к переключению метаболизма сахара с пентозофосфатного пути на путь Энтнера—Дудорова (табл. 1).
Наибольшая активность ферментов углеводного метаболизма у другого штамма — S. sibiricus SSO обнаружена также в клетках, выросших в условиях принудительной аэрации. Судя по активности ферментов, метаболизм углеводов в клетках штамма SSO в условиях интенсивной аэрации среды осуществляется по фруктозобисфосфатному пути и пути Энтнера—Дудорова (табл. 1). В отсутствие принудительной аэрации, при затрудненном доступе воздуха у штамма SSO оперируют два пути — фрук-тозобисфосфатный и путь Энтнера—Дудорова, т.е. те же, что и у штамма N1. При этом в указанных условиях активность всех ферментов у штамма SSO уменьшается. Таким образом, независимо от усло-
Таблица 1. Активность ферментов углеводного метаболизма (нмоль/(мин • мг белка)) в клетках сульфобацилл, выросших при разном кислородном режиме
Фермент S. sibiricus N1 S. sibiricus SSO S. thermosulfidooxidans subs. asporogenes
Интенсивная аэрация Без интенсивной аэрации (I пассаж) Без интенсивной аэрации (XI пассаж) Интенсивная аэрация Без интенсивной аэрации Интенсивная аэрация Без интенсивной аэрации
Гексокиназа КФ 2.7.1.1 42.4 13.6 3.3 8.3 2.7 28.5 39.2
Глюкозо-6-фосфатде- 215.0 64.4 28.8 7.8 2.0 101.2 40.0
гидрогеназа КФ 1.1.1.49
6-Фосфоглюконатде- 12.1 3.7 Н.о. Н.о. Н.о. 4.2 22.3
гидрогеназа КФ 1.1.1.43
6-Фосфоглюконатдегидратаза Н.о. 36.2 11.4 23.3 8.9 0.9 Н.о.
КФ 4.2.1.12 + 2-Кето-3-дезок-
си-6-фосфоглюконатальдолаза
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.