ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 45, № 2, с. 156-162
УДК 581.1
РЕГУЛЯЦИЯ ОБРАЗОВАНИЯ МАТРИКСНЫХ ФЕРМЕНТОВ ПЕРОКСИСОМ (АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ И КАТАЛАЗЫ) ПРОДУКТОМ ГЕНА MTH1 У МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ Pichia methanolica
© 2009 г. О. А. Леонович*, Ю. А. Куралес*, Т. А. Дутова**, Е. П. Исакова*, Ю. И. Дерябина*,
Я. М. Рабинович*
*Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: rabin_ya@mail.ru, elen_iss@mail.ru **ГосНИИгенетика, Москва, 113545 Поступила в редакцию 19.03.2008 г.
Изучали два независимых мутантных штамма метилотрофных дрожжей Pichia methanolica (mth1arg1 и mth2arg4), полученных из исходной линии 616 (ade1ade5). Исследуемые мутанты характеризовались дефектами по генам MTH1, MTH2, определяющими их неспособность усваивать метанол в качестве единственного источника углерода и пониженную активность фермента алкогольоксидазы (АО). Методом анализа молекулярных форм изозимов исследовали функционирование генов: AUG2, кодирующего одну из субъединиц АО, и СТА1, возможного гомолога пероксисомальной каталазы Saccharomyces cereviseae. Показано, что условия, благоприятные для экспрессии гена AUG2 (рост на среде с 3% метанола) приводили к увеличению синтеза пероксисомальной каталазы. У мутанта mth1 наблюдали преобладающее образование изоформы АО с электрофоретической подвижностью, типичной для изогенной формы 9, продукта гена AUG2, и пониженный уровень синтеза пероксисомальной каталазы. Восстановление роста на метаноле у четырех спонтанных ревертантов мутанта mth1 (Rmth1), сопровождалось увеличением активности как изогенной формы 1 АО, так и пероксисомальной каталазы. Полученные результаты подтверждают функциональную целостность структурного гена АUG2 у мутанта mth1. Корреляция уровней ферментативных активностей пероксисомальной каталазы и изоформы 1 АО в разных условиях свидетельствует о наличии общих регуляторных элементов, участвующих в функционировании генов AUG2 и СТА1 у метилотрофных дрожжей P. methanolica.
Дрожжи Pichia methanolica - факультативные метилотрофы, способные усваивать различные источники углерода, в том числе метанол, этанол, ацетат и ряд других соединений, в том числе, глюкозу [1]. В последнее время эта группа микроорганизмов привлекает к себе особенное внимание как объект молекулярно-генетических исследований механизмов индукции экспрессии генов [2] и изучения биосинтеза пероксисомальных ферментов [3]. Кроме того, недавно было установлено, что метилотроф-ные дрожжи, в частности, P. methanolica и Candida boidinii, в числе немногих микроорганизмов способны утилизировать растительный пектин, играя важную физиологическую и экологическую роль в осуществлении "цикла метанола" в окружающей среде [4, 5]. Это дает основания считать метилотрофные дрожжи чрезвычайно перспективной моделью для решения как научных, так и прикладных задач.
Ключевую роль в процессах диссимиляции метанола в дрожжах играет пероксисомальный фермент АО (КФ 1.1.3.13) [6-8], активная форма которого включает восемь субъединиц (октамер) и кодируется у дрожжей P. methanolica двумя генами, обозначенными соответственно AUG1 (MOD1) и AUG2(MOD2) [9-11]. Экспрессия этих генов у
P. methanolica при росте на среде с 3% метанола приводит к образованию девяти изозимов АО [10—13], представляющих собой два фермента изогенного состава и семь - гетерогенного (гибридного) состава с разной долей продуктов генов AUG1 и AUG2. Делеция любого из этих двух генов влечет за собой синтез изогенной формы АО с подвижностью либо первого, либо девятого изозимов [13]. Этот факт позволяет проводить анализ молекулярного состава изозимов АО для выявления нарушения регуляции активности генов AUG1 и AUG2 у дрожжей P. methanolica. Поскольку при репрессии глюкозой или этанолом АО не индуцируется, то очевидно существование репрессирующих регуляторных элементов при экспрессии продуктов генов AUG1 и AUG2 [13, 14]. Сравнительное исследование экспрессии генов АО на разных субстратах выявило, что активность гена AUG1 наблюдалась и в отсутствие источника углерода, тогда как активность гена AUG2 проявлялась только в присутствии метанола и достигала сопоставимых величин экспрессии при концентрации метанола выше 2% [11, 13]. Основываясь на этих результатах, ген AUG1 (MOD1) был назван конститутивным, а ген AUG2 (MOD2) -индуцибельным.
Другим важнейшим матриксным ферментом пероксисом является каталаза (КФ 1.11.1.6), синтез и активность которой у метилотрофных дрожжей тесно взаимосвязаны с функционированием ферментного комплекса АО [15]. Каталаза пероксисом у дрожжей S. cereviseae кодируется геном CTA1 [16]. Уровень каталазы, как и АО, увеличивается в условиях, благоприятных для биогенеза пероксисом [7, 17]. Экспрессия CTA1 индуцируется в стационарной фазе роста дрожжей [18] и не зависит от окислительного стресса или присутствия тиоловых соединений. В клетках дрожжей присутствует также и кодируемая геном CTT1 цитоплаз-матическая каталаза, уровень экспрессии которой зависит от внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса [19].
Известно, что уровень пероксисомальной каталазы обычно коррелирует с высокой активностью АО [8], и мутанты, дефектные по одному из этих ферментов, теряют способность роста на метаноле [6]. Однако, механизмы взаимодействия генов, кодирующих ключевые ферменты метаболизма метанола мало, либо совсем не изучены.
Цель работы - сравнительный анализ синтеза и каталитической активности АО и каталазы у разных штаммов дрожжей P. methanolica, дефектных по признаку роста на метаноле, и их ревертантов в условиях индукции этих ферментов различными источниками углерода.
МЕТОДИКА
Использовали штамм дрожжей P. methanolica 616 (ade1ade5) дикого типа, утилизирующий метанол и являющийся исходным для получения коллекции мутантов, дефектных по признаку роста на метаноле [20], либо штамм дрожжей P. methanolica MH4-1032, не несущий каких-либо мутаций по аук-сотрофности. С целью выявления особенностей генетического контроля экспрессии генов, ответственных за образование октамерного фермента АО, была создана коллекция мутантных mth-штам-мов P. methanolica. Идентификация изоформ фермента АО показала, что группа штаммов mth1 характеризовалась отсутствием на зимограммах продукта гена AUG1, в то время как мутанты группы mth2 - продукта гена AUG2 (по предварительным данным Е.М. Курбатовой и H.H. Мордкович) [20]. Кроме того, мутантные штаммы P. methanolica отличались уменьшенным количеством гибридных изоформ АО.
Исследовались 2 мутантных штамма: P. methanolica 2679 (mth1 arg1) и P. methanolica 2669 (mth2 arg4), которые характеризовались пониженной активностью АО [20]. Состав сред и методы определения фенотипа мутантов приведены в работе [20]. Методы генетической работы с дрожжами P. methanolica описаны в [21]. Полученные мутанты - удоб-
ный инструмент исследования участия генов группы MTH в синтезе и поддержании стабильности различных форм АО.
Спонтаннные ревертанты по mthl штамма P. methanolica 2679 получали в виде клонов спонтанным мутагенезом на отпечатках на агаризо-ванной среде с 1% метанола после длительной инкубации (3-4 недели) при комнатной температуре. Проверка полученных ревертантов на селективных средах показала, что все ревертанты сохранили исходную мутацию по ауксотрофности argl.
Клетки дрожжей выращивали при 28°C в колбах Эрленмейера объемом 750 мл на качалке при 150 об./мин в 80 мл жидкой среды следующего состава (%): (NH4)2SO4 - 0.3, KH2PO4 - 1.3; Na2HPO4 -0.1; MgSO4 - 0.05; CaCl2 - 0.01; дрожжевой экстракт - 0.1; аденин и аргинин в средах для ауксотро-фов - 20 мг/л [22]. В качестве источника углерода использовали 1%-ную глюкозу. После 22 ч выращивания до стационарной фазы роста клетки P. methanolica отделяли центрифугированием и ресуспенди-ровали в равном объеме свежей среды без источника углерода в стерильных условиях. Индукцию синтеза АО у дрожжей проводили при 28°C в колбах Эрленмейера (750 мл) на качалке в жидкой среде без источника углерода, с 3% метанола, с 1% глицерина и 2% глюкозы в течение 4 или 22 ч.
Клетки P. methanolica собирали и суспендировали в соотношении 1 г биомассы в 1 мл среды следующего состава: 10 мМ Mes, 0.5 M сорбит, 0.5 M маннит, 5 мМ ЭДГА, 0.5 мM ПМСФ (PMSF - фенилметил-сульфонилфторид), pH 6.5. Разрушение дрожжей проводили на ультразвуковом дезинтеграторе MSE ("Farmacia", Швеция) в течение 2 мин при 0°С. Полученный гомогенат центрифугировали при 20000 g 30 мин. В этих условиях приблизительно 90% пероксисом разрушались, и активность матриксных ферментов пероксисом обнаруживалась в супернатанте.
Активность АО и каталазы измеряли in vivo или in vitro при 25°С в ячейке с электродами, закрытыми фторопластовой пленкой [23]. На ячейке поддерживали постоянную разность потенциалов 660 мВ. Величина тока оцифровывалась 24-разрядным аналого-цифровым преобразователем с частотой оцифровки 10 раз в секунду и передавалась на компьютер. Суспензию дрожжевых клеток (1-5 х 108 кл.) или 10-100 мкг белка супернатанта помещали в 1 мл 50 мМ К-фосфатного буфера, рН 6.5, и измеряли скорость поглощения кислорода без субстрата и после добавления в ячейку метанола до концентрации 1% при измерении активности АО, или Н2О2 в конечной концентрации 1 мМ при измерении активности каталазы. Активность АО (каталазы) рассчитывали как разницу в скорости поглощения (выделения) кислорода в присутствии метанола (Н2О2) и без субстрата, и выражали в нг-атом О2 х мин/с х 108 кл., или в относительных единицах (tga х мг белка-1).
Для выделения АО и пероксисомальной катала-зы клетки дрожжей P. methanolica дикого типа выращивали в жидкой среде с 1% метанола. Клетки отделяли центрифугированием, промывали дистиллированной водой и переосаждали, затем суспендировали в буфере (0.05 М КИ^О^аОИ, рН 7.5) и разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе 3 мин при 0°С. Неразрушенные клетки, клеточные стенки и другие крупные внутриклеточные фрагменты отделяли центрифугированием 15 мин при 4°С и 4000 g. К полученному бесклеточному экстракту при перемешивании добавляли насыщенный раствор (КИ4)28О4 (до 40% насыщения), рИ доводили до 7.5 и перемешивали 12 ч при 4°С. Ос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.