МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 3, с. 281-290
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.8.043:615.33.015.46
РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЦЕССА ФОРМИРОВАНИЯ БИОПЛЕНОК PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS В СИСТЕМЕ IN VITRO
© 2015 г. А. В. Ганнесен*, М. В. Журина*, М. А. Веселова**, И. А. Хмель**, В. К. Плакунов*, 1
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва **Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва Поступила в редакцию 21.10.2014 г.
Установлено, что у мутантов Pseudomonas chlororaphis 449 с частично или полностью подавленным накоплением N-ацилгомосеринлактонов способность к стимуляции роста биопленок в присутствии азитромицина резко снижена или полностью отсутствует. Биопленки штамма дикого типа, предформированные в присутствии стимулирующих концентраций азитромицина, интенсивнее окрашиваются специфичным для полисахаридов красителем 1,9-диметилметиленовым синим (DMMB) и более устойчивы к тепловому шоку. Это указывает на накопление в них структурных полисахаридов матрикса, выполняющих защитную роль при тепловом шоке. Сверхнизкие концентрации азитромицина (0.001—0.01 мкг/мл) ингибируют рост биопленок P. chlororaphis 449 и P. chlororaphis 66 с преимущественным подавлением синтеза полисахаридов, окрашиваемых DMMB.
Ключевые слова: биопленки, антибиотики, активация формирования биопленок, quorum sensing.
DOI: 10.7868/S0026365615030040
В формировании бактериальных биопленок принимает участие большое количество регуля-торных систем, компонентами которых являются, прежде всего, циклический дигуанозинмонофос-фат (c-di-GMP), а также "малые" РНК (sRNA), производные индола и ряд других веществ [1]. Одной из наиболее важных систем глобальной регуляции метаболизма, участвующей в формировании биопленок, является система "quorum sensing" (QS).
Работа систем QS у грамотрицательных бактерий опосредуется белками двух типов: одни белки отвечают за синтез сигнальных молекул, чаще всего N-ацилгомосеринлактонов (АГЛ), обычно называемых аутоиндукторами, а второй тип белков взаимодействует с аутоиндуктором, запуская транскрипцию специфических генов [2-4]. Известно более 70 родов a-, Р-, у-протеобактерий, использующих системы QS, функционирующие с участием АГЛ [5]. У Vibrio fisheri синтез АГЛ контролируется геном luxI, кодирующим АГЛ-синта-зу LuxI. При достижении критического порога концентрации происходит присоединение АГЛ к транскрипционному активатору LuxR и запуск транскрипции QS-зависимых генов, в том числе и luxI. Таким образом происходит лавинообразное нарастание концентрации сигнальных молекул в среде. АГЛ могут свободно диффундировать
1 Автор для корреспонденции (e-mail: plakunov@inmi.host.ru).
внутрь и наружу клеток, пул АГЛ коррелирует с плотностью клеток. Это обеспечивает контроль экспрессии генов в зависимости от плотности популяции. У бактерий рода Pseudomonas функционируют по крайней мере три системы QS. Наиболее изученные системы, LasIR и RhIIR (гомологи системы LuxIR ), в качестве сигнальных молекул используют АГЛ, а третья система AQ является алкилхинолон-зависимой [6, 7].
Хотя участие АГЛ-зависимых QS-систем в формировании биопленок показано во многих работах, молекулярные механизмы этих процессов остаются не полностью расшифрованными. Недавно показано, что инактивация гена cvil синтазы АГЛ у Chromobacterium violaceum приводит к нарушению синтеза полисахаридных компонентов внеклеточного полимерного матрикса (ВПМ) биопленок, что сопровождается повышением чувствительности биопленок к экстремальным факторам среды и антибиотикам [8, 9].
Целью данной работы было изучение действия низких (суббактериостатических) концентраций азитромицина на штаммы дикого типа, модифицированные штаммы и мутанты P. chlororaphis с повреждением некоторых глобальных регулятор-ных систем для выявления участия этих систем в регуляции данным антибиотиком формирования биопленок.
Свойства бактерий, использованных в работе
Штаммы бактерий Характеристика штамма Источник
Р. сЫогогарЫз 449 Прототроф; синтезирует АГЛ Коллекция Института молекулярной генетики РАН
Р. сЫогогарЫз 66 Прототроф; синтезирует АГЛ Коллекция Института молекулярной генетики РАН
Р. сЫогогарЫз 449, мутант 2 Мутация в гене гроБ; синтезирует АГЛ [10]
Р. сЫогогарЫз 449, мутант 3 Мутация в гене gacS; синтез АГЛ снижен [11]
Р. сЫогогарЫз 449, мутант 4 Мутация в гене phzB; синтезирует АГЛ [11]
Р. сЫогогарЫз 449, мутант 5 Мутация в гене phzA; синтезирует АГЛ [11]
Р. сЫогогарЫз 449/рМЕ6000, штамм 6е Содержит векторную плазмиду рМЕ6000, Те-г; синтезирует АГЛ [11]
Р. сЫогогарЫз 449/рМЕ6863, штамм 7е Содержит плазмиду рМЕ6863, включающую клонированный ген апЛ, Те-г; АГЛ не накапливает [11]
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. Объектами исследования были чистые культуры грамотрицательных са-протрофных бактерий Р. МогогарЫз (штаммы 66 и 449), а также модифицированные штаммы и мутанты последнего, полученные в лаборатории регуляции экспрессии генов микроорганизмов Института молекулярной генетики РАН и представленные в коллекции ИМГ РАН. Основные характеристики этих организмов суммированы в таблице.
ОП540
J_I_I_I_I_I
0 4 8 12 16 20 24
Время, ч
Рис. 1. График, иллюстрирующий способ расчета чувствительности планктонной культуры Р. МогогарМз 449 к тепловому шоку: 29°С (1); 34°С (2); 37°С (3); 45°С (4).
Культивирование и хранение микроорганизмов.
Микроорганизмы сохраняли на полужидкой (0.3% агара) среде ЬВ в столбиках под вазелиновым маслом при 4—6°С. В случае мутантов 2, 3, 4 и 5 в среду при хранении вносили стерильный раствор канамицина (конечная концентрация 100 мкг/мл), а в случае штаммов 6е и 7е использовали стерильный раствор тетрациклина (до конечной концентрации 40 мкг/мл). Бактерии выращивали на жидкой среде ЬВ при 29—30°С на качалке (150 об/мин) в течение 20—24 ч. Эти культуры использовали как инокулят в опытах с биопленками.
Получение биопленок и изучение их чувствительности к ингибиторам осуществляли, как описано в предыдущей работе [9].
Влияние теплового стресса на рост биопленок Р. МогогарЫи 449 в присутствии азитромицина.
Чувствительность планктонной культуры и биопленок к тепловому стрессу характеризовали отношением прироста показателя (оптической плотности или светорассеяния), пропорционального биомассе измеряемого объекта, в присутствии или в отсутствие азитромицина при изучаемых температурах к его приросту при оптимальной температуре (29°С). Метод расчета представлен на рис. 1 на примере планктонной культуры Р. сМогогарЫз 449 без антибиотика. Культуру пре-инкубировали в течение 6 ч — времени, необходимого для проявления "биопленочного" фенотипа и начала формирования матрикса [8]. Оптическая плотность (ОП) по светорассеянию суспензии планктонных клеток в данном примере через 6 ч достигала величины 0.6 (540 нм). После переноса культуры на изучаемые температуры инкубацию продолжали еще 24 ч. Прирост оптической плотности суспензии планктонных клеток при 29°С
ОП от контроля без азитромицина, %
Концентрация азитромицина, мкг/мл
Рис. 2. Зависимость роста планктонной культуры (1, 3) и биопленки (2, 4) P. chlororaphis 449 (1, 2) и мутанта 2 (3, 4) от концентрации азитромицина. Окрашивание биопленки КФ. На этом и на последующих рисунках пунктирная прямая показывает уровень контроля без добавления антибиотика.
ОП от контроля без азитромицина, %
Концентрация азитромицина, мкг/мл
Рис. 3. Зависимость роста планктонной культуры (1, 3) и биопленки (2, 4) P. chlororaphis 449 (1, 2) и мутанта 3 (3, 4) от концентрации азитромицина. Окрашивание биопленки КФ.
ОП от контроля без азитромицина, %
Концентрация азитромицина, мкг/мл
Рис. 4. Зависимость роста планктонной культуры (1, 3) и биопленки (2, 4) P. chlororaphis 449 (1, 2) и мутанта 4 (3, 4) от концентрации азитромицина. Окрашивание биопленки КФ.
ОП от контроля без азитромицина, %
Концентрация азитромицина, мкг/мл
Рис. 5. Зависимость роста планктонной культуры (1, 3) и биопленки (2, 4) P. chlororaphis 449 (1, 2) и мутанта 5 (3, 4) от концентрации азитромицина. Окрашивание биопленки КФ.
составил: 2.6 — 0.6 = 2.0 ед. ОП. Эту величину принимали за 100%. Аналогично рассчитывали прирост культуры при других температурах, например, при 37°С. В данном случае он составил: 1.6 — 0.6 = 1.0 ед. ОП. Таким образом, относительный прирост при этой температуре равен 1.0/2.0 х х 100 = 50%. Именно эту величину откладывали на графиках (рис. 2—9). Подобным же образом рассчитывали относительный прирост биопле-
нок (на основании оптической плотности раствора красителей, экстрагированных из предварительно окрашенных биопленок). Для кристаллического фиолетового (КФ) измерения производили при 590 нм, для 1,9-диметил-метилено-вого синего (DMMB) при 670 нм) [9].
Микроскопия. Для исследований методами фазово-контрастной микроскопии (ФКМ) и эпи-флуоресцентной микроскопии (ЭФМ) использо-
ОП от контроля без азитромицина, %
Концентрация азитромицина, мкг/мл
Рис. 6. Зависимость роста планктонной культуры (1, 3) и биопленки (2, 4) Р. МогогарМз 449 (1, 2) и штамма 6е (3, 4) от концентрации азитромицина. Окрашивание биопленки КФ.
ОП от контроля без азитромицина, %
_I_I_I_I_I_I_^¿J_I_I_I_I_I_I_1
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 1 2 3 4 5 6 7 8 Концентрация азитромицина, мкг/мл
Рис. 7. Зависимость роста планктонной культуры (1, 3) и биопленки (2, 4) Р. МогогарМз 449 (1, 2) и штамма 7е (3, 4) от концентрации азитромицина. Окрашивание биопленки КФ.
вали микроскоп Axio Imager, D1 Carl Zeiss, объектив х40. Биопленки формировали на предметных стеклах. С этой целью стандартные стекла разрезали стеклорезом вдоль на три части и очищали выдерживанием в течение 1 сут в хромовой смеси. Отмытые стекла стерилизовали в пробирках с 5 мл среды LB (1 ати), куда затем вносили 50 мкл ино-кулята. После выращивания культуры в течение 24 ч суспензию планктонных клеток сливали, стекла подсушивали, и биопленки фиксировали осторожным нагреванием в пламени горелки. Для ФКМ окрашивание биопленок проводили красителем DMMB согласно [12] с некоторыми изменениями. Для получения раствора красителя 20 мг DMMB (двойная соль с хлоридом
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.