научная статья по теме РЕГУЛЯЦИЯ СПОНТАННЫХ СИНХРОННЫХ ОСЦИЛЛЯЦИЙ CA2+ В НЕЙРОНАХ ГИППОКАМПА ГАМКЕРГИЧЕСКИМИ НЕЙРОНАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ КАИНАТНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕЗ ДЕСЕНСИТИЗАЦИИ Биология

Текст научной статьи на тему «РЕГУЛЯЦИЯ СПОНТАННЫХ СИНХРОННЫХ ОСЦИЛЛЯЦИЙ CA2+ В НЕЙРОНАХ ГИППОКАМПА ГАМКЕРГИЧЕСКИМИ НЕЙРОНАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ КАИНАТНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕЗ ДЕСЕНСИТИЗАЦИИ»

УДК 577.352.465

РЕГУЛЯЦИЯ СПОНТАННЫХ СИНХРОННЫХ ОСЦИЛЛЯЦИЙ Ca2+ В НЕЙРОНАХ ГИППОКАМПА ГАМКЕРГИЧЕСКИМИ НЕЙРОНАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ КАИНАТНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕЗ ДЕСЕНСИТИЗАЦИИ © 2012 г. А. В. Кононов1, Н. В. Баль1, 2, В. П. Зинченко1, 2

Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки РАН,

ул. Институтская, д. 3, Пущино Московской области; тел.: (4967) 739-162; факс: (4967)330-509; электронная почта: vpz@mail.ru 2Пущинский государственный университет, 142290, Пущино Московской области Поступила в редакцию 31.08.2011 г.

Ранее мы показали, что в культуре клеток гиппокампа крыс небольшой процент нейронов в ответ на агонисты глутаматных каинатных рецепторов генерируют кальциевый сигнал необычно большой амплитуды без признаков десенситизации (Кононов и др. 2011. Биол. мембраны. 28 (2), 127— 136). Настоящая работа посвящена идентификации этих нейронов и установлению их функции. Показано, что агонисты каинатных рецепторов ингибируют спонтанные синхронные кальциевые осцилляции в популяции нейронов, понижая базальный уровень концентрации ионов кальция в цитоплазме большинства клеток и сильно повышая его в единичных нейронах. После отмывки аго-ниста колебания восстанавливались во всех клетках после лаг-фазы, длительность которой определялась временем понижения концентрации Са2+ до суббазального уровня в нейронах с необычно высокой амплитудой Са2+-сигнала. Такое поведение указывает на управляющую роль данных нейронов в синхронной активности всей популяции. Для определения подтипа каинатных рецепторов этих нейронов мы использовали более селективные в отношении определенных субъединиц рецепторов агонисты и показали, что каинатные рецепторы нейронов с необычно высокой амплитудой Са2+-ответа без десенситизации содержат субъединицу GluR5/GLUK1. Отметив местоположение этих нейронов, мы зафиксировали препарат и покрасили клетки антителами против глутаматде-карбоксилазы, фермента, который селективно экспрессируется в ГАМКергических нейронах. Эксперимент показал, что антитела локализованы в нейронах, которые генерировали Са -ответ на агонист каинатных рецепторов необычно высокой амплитуды без десенситизации. Таким образом, нами показано, что ГАМКергические нейроны могут подавлять синхронную активность большой популяции нейронов через активацию глутаматом пресинаптических каинатных рецепторов, содержащих субъединицу GluR5/GLUK1.

Ключевые слова: глутаматные каинатные рецепторы, концентрация кальция, культура клеток гип-покампа, флуоресценция, каинатный рецептор, ГАМКергический нейрон, десенситизация.

Дифференцировка клеток приводит к появлению сотен различных типов нейронов в мозге [1]. Хотя в некоторых случаях (десятки типов) нейроны можно отличить по морфологическим признакам, в большинстве случаев для идентификации необходимы комплексные исследования с применением электрофизиологии, селективных антител и систем анализа изображения. Последние представляются наиболее перспективными,

Сокращения: [Са2+]^ — концентрация ионов кальция в ци-тозоле, ГАМК — у-аминомасляная кислота, АМРА — а-ами-но-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовая кислота, КА — каинат, ОУК1-52466 — селективный антагонист АМРА-рецептора, АТРА — агонист 01иК5-субъединицы КА-рецептора, SYM2081 — агонист 01иК5 и 01иК6-субъ-единиц КА-рецептора, ЦВР302 — селективный антагонист 01иИ5 рецепторов, ССКО — спонтанные синхронные кальциевые осцилляции.

поскольку позволяют регистрировать несколько параметров активности одновременно у сотен нейронов. Один из таких параметров — концентрация Са2+ в цитозоле ([Са2+];). При активации нейронов агонистами ионотропных рецепторов (глутаматных, ГАМК и других) в них происходят значительные изменения [Са2+]^ При этом кальциевые сигналы отдельных нейронов отличаются по форме и амплитуде, будучи настолько индивидуальными, что дают возможность использовать их в качестве своего рода "отпечатков пальцев" для идентификации нейронов мозга [2—5]. Установлено, что причины вариабельности кальциевых ответов клеток на агонисты ионотропных рецепторов и закономерности распределения ответов по форме и амплитуде обусловлены разным количеством рецепторов [6, 7], степенью их де-

сенситизации [3, 4, 8] и гетерогенностью по проводимости для ионов кальция [2—5, 9].

Количественные измерения [Са2+] с использованием двухволновых флуоресцентных зондов позволяют визуально идентифицировать индивидуальные клетки в культуре, оценить соотношение и состояние различных рецепторов и их изоформ в каждом нейроне, выявить новые механизмы взаимодействия нейронов, детектировать наиболее чувствительные к повреждающим воздействиям клетки, а также понять индивидуальное назначение каждого нейрона в данном отделе мозга.

Ранее мы исследовали причины вариабельности и закономерности распределения амплитуд кальциевых ответов отдельных нейронов в культуре клеток гиппокампа на агонисты каинатных (КА) глутаматных рецепторов [8]. Было показано, что большинство нейронов равномерно распределено по амплитуде кальциевого ответа на аго-нист КА-рецепторов. Однако среди сотен нейронов в популяции всегда присутствуют несколько клеток, отличающихся гораздо большей амплитудой Са2+-ответа без десенситизации. Поскольку большая амплитуда Са2+-ответа и отсутствие де-сенситизации обычно коррелируют с интенсивностью секреции нейротрансмиттеров, повышенной продукцией активных форм кислорода и избирательной гибелью нейронов [2, 3, 5, 10, 11], наличие такого сигнала косвенно указывало на управляющую функцию нейронов. Для выяснения функции данных нейронов мы исследовали влияние агонистов КА-рецепторов на спонтанные синхронные кальциевые осцилляции [Са2+] (ССКО) в нейронах.

ССКО наблюдали в нейронных сетях различных отделов мозга, а также в нейронах гиппокам-па in vitro [12]. Колебания уровня кальция в цито-золе являются важным признаком клеточной сигнализации, который связан с запуском и регуляцией секреции межклеточных трансмиттеров, а также с активацией экспрессии специфичных генов [13, 14]. Выявление механизмов контроля частоты и амплитуды ССКО в нейронах гиппокампа со стороны различных рецепторов открывает возможности управления отдельными популяциями клеток мозга с использованием ли-гандов этих рецепторов.

Известно, что при синхронных колебаниях уровня кальция в нейронах мозга передача сигнала от одной клетки к другой происходит посредством выделения в синапсе возбуждающего медиатора глутамата. В генерации и регуляции кальциевых колебаний принимают участие NMDA-[12], АМРА-рецепторы [15] и потенциал-чувствительные кальциевые каналы [12, 16]. ГАМК(А)-рецепторы являются эффективными регуляторами амплитуды, частоты и синхронности кальциевых колебаний [17, 18]. Лиганды каинатных ре-

цепторов также претенденуют на роль подобных регуляторов, однако об участии этих рецепторов в кальциевыгх колебаниях существуют противоречивые данные [15, 16, 19]. Трудности исследования этих рецепторов обусловлены, во-первых, тем, что до настоящего времени не найдено селективных лигандов для большинства субъединиц тетрамерного рецептора. Во-вторык, КА-ре-цепторы играют более сложную роль в синаптиче-ской пластичности, чем АМРА-рецепторы [20—22], благодаря своей локализации не только в пост-, но и в пресинаптической мембране, где они быстро и на длительный период активируют секрецию ГАМК и других трансмиттеров [20, 21]. В настоящей работе установлен тип нейронов, отвечающих высокоамплитудным Са2+-сигналом без десенситизации на агонист КА-рецептора. Установлены локализация, субъединичный состав и свойства КА-рецепторов, активность который подавляет ССКО в нейронах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. В работе использовали следующие среды и реактивы: нейробазальную среду, добавку B-27, Fura-2АМ, Hoechst 33342 (Invitrogen, США); домоевую кислоту, GYKI-52466, SYM2081, фторвиллардиин, AMPA, бикукуллин, ATPA, CGP54626, баклофен, UBP302 (Tocris, Bioscience, Англия); ConA, PBS (Sigma, США), среду Хенкса, эмбриональную сыворотку телят (MP Biomedicals, США); параформальдегид, первичные кроличьи антитела против глутаматде-карбоксилазы 65/67 (Abcam, Великобритания), вторичные антитела осла против антител кролика, конъюгированные с Atto 565 (НПФ "Биотехнологии").

Культуру клеток гиппокампа новорожденный крысят получали, как описано ранее [8]. Влияние каинатныгх рецепторов на ССКО изучали с использованием культуры нейронов гиппокампа на 9—14 день культивирования.

Измерения флуоресценции. Изменения [Ca2+] в нейронах регистрировали по интенсивности флуоресценции двухволнового Са2+-чувствительного зонда Fura-2 [23, 24]. Для измерения [Ca2+] использовали систему анализа изображений на базе инвертированного моторизованного микроскопа Leica DMI6000 B, оснащенного высокоскоростной монохромной CCD-камерой HAMAMATSU C9100, системой высокоскоростной смены возбуждающих светофильтров Leica's Ultra-Fast Filter Wheels (время переключения 10—30 мс). Для работы использовали объектив Leica HC PL APO 20 x 0.7 IMM. В качестве источника возбуждения флуоресценции использовали осветитель Leica EL6000 с ртутной лампой высокого давления HBO 103 W/2. Для возбуждения и регистрации флуоресценции Fura-2 использовали набор све-

РЕГУЛЯЦИЯ СПОНТАННЫХ СИНХРОННЫХ ОСЦИЛЛЯЦИЙ Ca2+

135

аб в

0 120 240 360 480 600 0 120 240 360 480 0 120 240 360

Время, с Время, с Время, с

Рис. 1. Подавление ССКО в нейронах агонистами КА-рецепторов. а — Две аппликации по 200 нМ домоевой кислоты, б — 10 мкМ SYM2081, агониста GluR5 и GluR6, в — 0.5 мкМ АТРА, агониста GluR5-субъединицы КА-рецептора. Аго-нисты вызывают повышение [Са2+]^ в одних нейронах (1) и понижают [Са2+]^ в других нейронах (2). Стрелки указывают на лаг-фазу.

тофильтров FU2 (Leica, Германия) с фильтрами возбуждения BP340/30 и BP387/15, светоделителем FT410 и фильтром эмиссии BP510/84. Полученные на двух различных каналах временные серии изображений обрабатывали в программе ImageJ совместно с программами Time Series Analyzer и RatioPlus. При обработке серий изображений измеряли амплитуду кальциевых ответов одиночных клеток, выраженную как отношение сигналов флуоресценции Fura-2 при возбуждении волнами 340 и 380

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком