научная статья по теме РЕГУЛЯЦИЯ ВОДНОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ СОБИРАТЕЛЬНЫХ ТРУБОК ПОЧКИ МЫШИ В ПОСТНАТАЛЬНОМ РАЗВИТИИ Биология

Текст научной статьи на тему «РЕГУЛЯЦИЯ ВОДНОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ СОБИРАТЕЛЬНЫХ ТРУБОК ПОЧКИ МЫШИ В ПОСТНАТАЛЬНОМ РАЗВИТИИ»

ОНТОГЕНЕЗ, 2009, том 40, № 3, с. 215-221

^=ФИЗИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ =

УДК 612.65/46+577.15/17

РЕГУЛЯЦИЯ ВОДНОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ СОБИРАТЕЛЬНЫХ ТРУБОК ПОЧКИ МЫШИ В ПОСТНАТАЛЬНОМ РАЗВИТИИ1

© 2009 г. Г. Р. Ходус*, Е. И. Соленов*' **, Л. Н. Иванова*' **

*Институт цитологии и генетики СО РАН 630090 Новосибирск, пр-т Лаврентьева, д. 10 **Новосибирский государственный университет 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, д. 2 E-mail: eugsol@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 23.09.08 г. Окончательный вариант получен 08.12.08 г.

На изолированных фрагментах собирательных трубок почки мыши линии C57BL/6J трех возрастных групп (9, 18 и 60-90 сут) исследовали водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок и реакцию на вазопрессин. Коэффициент осмотической водной проницаемости Pf оценивали по скорости набухания клеток после смены осмолярности среды с 300 до 200 мОсм/л. Установлено, что величина Pf у мышей в возрасте 9 сут достоверно ниже, чем у мышей в возрасте 18 сут, т.е. при окончании перехода на смешанное питание, но Pf у 18-суточных мышей еще не достигает таких значений, как у взрослых животных (Pf = 58.6 ± 7.7, 94.5 ± 8.8 и 168.4 ± 11.8 мкм/с соответственно). Аго-нист У2-рецепторов вазопрессина десмопрессин в концентрации 1 нМ достоверно повышал Pf как у 18-суточных, так и у взрослых мышей и не вызывал изменений у 9-суточных животных. Ингибитор протеинкиназы C Ro-31-8220 в концентрации 100 нМ подавлял влияние десмопрессина на Pf мышей в возрасте 18 сут и у взрослых животных, но не приводил к подавлению эффекта аналога вторичного посредника вазопрессина цАМФ - К6,02-дибутирил аденозин-3',5'цикломонофосфата, проникающего в клетки, на Pf плазматической мембраны клеток собирательных трубок. Таким образом, у мышей реакция эпителия собирательных трубок на вазопрессин появляется в конце вининга и коррелирует с ростом нестимулированной осмотической водной проницаемости плазматической мембраны клеток собирательных трубок. Предполагается, что для трансдукции сигнала вазопрессина через У2-рецепторы кроме механизма, опосредованного цАМФ, необходимо функционирование протеинкиназы С и кальцийзависимых систем внутриклеточных посредников.

Ключевые слова: почка, постнатальный онтогенез, вазопрессин, водная проницаемость.

Почка незрелорождающих млекопитающих, таких как мыши и крысы, в ранний постнатальный период нечувствительна к вазопрессину (Nash, Edelman, 1973; Dlouha, 1976; Elinder, 1980). Регуляция реабсорбции воды в собирательных трубках начинает проявляться в период перехода животного на самостоятельное питание. Развитие реакции собирательных трубок почки на вазопрессин связывают с постепенным формированием и сопряжением в главных клетках эпителия молекулярных механизмов трансдукции сигнала гормона. Так, у крыс происходит рост количества рецепторов вазопрессина V2 и активности адени-латциклазы (Соленов, Иванова, 1985, 1997; Imbert-Teboul et al., 1984; Siga, Horster, 1991; Ammar et al.,

1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных

исследований (проекты < 05-04-48213, 08-04-00541, 09-04-

00197) и Фондом Президента РФ "Поддержка ведущих на-

учных школ РФ" (проект НШ-7071.2006.4).

1992; Tiansheng et al., 1997). В этот же период проявляется увеличение ГТФазной активности G-белков и их сопряжение с рецептором вазопрессина (Зеленина и др., 1994). Происходит смена цитозольной изоформы RI регуляторной субъединицы протеинкиназы A на изоформу RII (Соленов, Иванова, 1985). У крыс и мышей в течение постнатального онтогенеза в плазматической мембране постепенно увеличивается содержание аквапоринов, формирующих водные каналы (Bonilla-Felix, Jiang, 1997; Yamamoto et al., 1997; Yao et al., 2004). В конечном счете процессы, протекающие в почке в постнатальном онтогенезе, приводят к повышению эффективности функции осмотического концентрирования и к появлению реакции эпителия собирательных трубок на вазопрессин (Соленов и др., 2001; Siga, Horster, 1991).

В последнее время значительное внимание уделяется исследованию механизмов регуляции

транспорта воды через эпителий собирательных трубок, опосредованных, помимо цАМФ, другими внутриклеточными посредниками. Известно, что в ходе постнатального онтогенеза меняется экспрессия изоформ протеинкиназы С, и ее ингибиро-вание приводит к нарушению нефрогенеза (Saxena et al., 1994; Serlachius et al., 1997; Redling et al., 2004). Но роль этого фермента в созревании осморегу-лирующего действия вазопрессина не определена. Настоящая работа посвящена исследованию развития регуляции вазопрессином водной проницаемости клеток собирательных трубок почки мыши в постнатальном онтогенезе и выяснению роли протеинкиназы С в этом процессе.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Животные. В экспериментах использовали мышей линии C57BL/6J трех возрастных групп: 9-12 сут (период ареактивности к вазопрессину), 17-19 сут (переход на самостоятельное питание и проявление реакции на вазопрессин) и взрослых животных в возрасте 60-90 сут. Мышей получали из лаборатории экспериментальных животных ИЦиГ СО РАН, Новосибирск.

Для снижения уровня эндогенного вазопрессина взрослых животных подвергали повышенной гидратации. Для этого за 48 ч до эксперимента их лишали корма и обеспечивали неограниченный доступ к 5%-ному водному раствору сахарозы.

Получение фрагментов собирательных трубок. Для получения суспензии фрагментов собирательных трубок мозгового вещества почки использовали методику, описанную ранее (Соленов и др., 2001).

Протоколы экспериментов. Инкубацию с различными агентами проводили в среде MEM с 15 мМ буфера HEPES ("Sigma", США) при 37°С в атмосфере 5%-ного CO2 и 95%-ного воздуха. Были проведены следующие серии экспериментов.

1. Оценка эффекта селективного агониста У2-рецепторов десмопрессина на водную проницаемость плазматической мембраны клеток собирательных трубок. После измерения коэффициента осмотической водной проницаемости P, которое принимали за контроль, изолированный фрагмент канальца инкубировали с десмопресси-ном (1 нМ, "Sigma", США) 15 мин при 37°С и далее проводили измерение P.

2. Оценка эффекта проникающего аналога цАМФ К6,02-дибутирил аденозин-3',5' цикломо-нофосфата (дибутирил-цАМФ). После контрольного измерения Pf каналец инкубировали с 100 мкМ дибутирил-цАМФ ("Sigma", США) 20 мин при 37°С

с последующим измерением осмотической водной проницаемости.

3. Выявление действия ингибитора протеинкиназы C на эффект десмопрессина и дибутирил-цАМФ. Фрагменты собирательных трубок инкубировали с ингибитором протеинкиназы C Ro-31-8220 (0.1 мкМ, "CalbioChem", США) 10 мин, далее измеряли Pf, эффект десмопрессина и дибутирил-цАМФ оценивали согласно протоколам 1 и 2.

Измерение водной проницаемости. Метод измерения коэффициента водной проницаемости Pf плазматической мембраны клеток на открытом конце почечного канальца использует световую микроскопию в темном поле и цифровую запись изображения с последующим ее автоматическим анализом. Оценку водной проницаемости плазматической мембраны клеток собирательных трубок проводили с помощью метода, опубликованного ранее, с некоторыми модификациями, заключающимися в формировании изображения c помощью микроскопии в темном поле и автоматической морфометрии (Соленов, Иванова, 1999; Соленов и др., 2001).

Суспензию канальцев объемом 100-200 мкл наносили на стекло, покрытое полилизином, и помещали в перфузионную камеру, укрепленную на объективе микроскопа ЛОМО Микмед-2 (водоиммерси-онный об. х40, темнопольный конденсор КОН-7Т). В камере производили быструю смену растворов PBS (~70 мс) - с изоосмотического (-300 мОсм) на ги-поосмотический (-200 мОсм). Кинетику изменения объема клеток записывали с помощью черно-белой цифровой видеокамеры FUM-930H ("Fuho Technology", Корея) с сохранением записи в персональном компьютере. Измерение водной проницаемости проводили при комнатной температуре.

Анализ изображения. Изображение собирательной трубки в темном поле можно представить в виде двумерной матрицы, элементом которой является величина яркости пикселей изображения. Диапазон яркости в нашей системе составлял от 0 до 255. Принимается, что границы канальца можно определить как группу пикселей, яркость которых превышает определенный порог (рис 1, а). Подобранный опытным путем порог яркости, который характеризует границы канальца, лежит в диапазоне от 40 до 60 (рис. 1, б). На одном из кадров видеозаписи выделяли определенный фрагмент канальца, на нем считали число пикселей S выше определенного порога яркости в каждом кадре видеозаписи. Полученные данные площади S далее использовали в расчете коэффициента водной проницаемости.

250 -

200 -

150 -

100 -

50 -

0 - А—. I

-50 0

В

-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400

Рис. 1. Вид открытого конца фрагмента собирательной трубки почки мыши (темнопольная микроскопия): а - показан пороговый уровень яркости, соответствующий контуру изображения канальца; б - профиль яркости, соответствующий линии АВ на а; точки А, В, А', В' соответствуют точкам на а. По оси абсцисс - расстояние, х0.1 мкм; по оси ординат - интенсивность света, усл. ед.

а

Расчет коэффициента водной проницаемости тотальной клеточной поверхности. Коэффициент осмотической водной проницаемости Р ^ рассчитывали по формуле

Р/ = Кг/п80У^С,

где Кг - коэффициент линейной регрессии индекса объема 53/2, п = 4 - поправочный коэффициент, 50 - начальная площадь, Ум; - молярный объем воды, АС - разность осмотических концентраций. Подробный вывод формулы был описан ранее (Соленов и др., 2001).

Статистика. Для оценки достоверности различий в изучаемых группах применяли ¿-крите-рий Стьюдента для парных сравнений. Различия признавали достоверными при р < 0.05. Для сравнения независимых выборок анализ достоверности различий проводили с помощью однофактор-ного дисперсионного анализа. Различия признавали достоверными при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты измерения водной проницаемости собирательных трубок почки до и после воздействия десмопрессином представлены на рисунке 2, а. У мышей в возрасте 9-12 сут величина Р $ почти в три раза ниже, чем у взрослых животных. Этот параметр достоверно повышается к во

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»