= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =
УДК 577.113:579.864
РЕКЛАССИФИКАЦИЯ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ РОДА Lactobacillus
© 2010 г. С. Г. Ботина1, 2, К. М. Климина1, Н. В. Коробан2, А. М. Амерханова3,
В. В. Зинченко2, В. Н. Даниленко1
1 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, Москва 119991;
e-mail: svetabotina@yahoo.com 2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра генетики, Москва 119992 3 Федеральное государственное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, Москва 125212 Поступила в редакцию 13.01.2010 г.
Изучены 13 штаммов производственных культур бактерий рода Lactobacillus (из коллекции ГКНМ ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского), использующихся на территории Российской Федерации на протяжении многих лет в качестве заквасочных культур при производстве кисломолочных продуктов, в качестве пробиотических препаратов, биологически активных добавок к пище и ветеринарных препаратов. Впервые проведен комплексный анализ данных о культурах, полученных с использованием микробиологических и молекулярно-генетических методик. Исследованы их биохимические характеристики и определена последовательность проксимального участка гена 16S рРНК. Показано, что использование тест-системы API-50CHL дает возможность более точной биохимической идентификации бактерий рода Lactobacillus по сравнению с набором АНАЭРОТЕСТ-23. По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК установлено, что все исследуемые штаммы обнаруживают гомологию проксимального участка этого гена с типовыми представителями рассматриваемых видов на уровне 97-99%. Полученные данные позволили провести таксономическую реклассификацию видового положения изучаемых культур с учетом современного уровня систематики. Нуклеотидные последовательности фрагментов генов изучаемых штаммов лактобацилл депонированы в базу данных NCBI под номерами GU560031, GU560032, GU560033, GU560034, GU560035, GU560036, GU560037, GU560038, GU560039, GU560040, GU560041, GU560042, GU560043.
Лактобациллы составляют большую гетерогенную группу грамположительных, неспорооб-разующих, неподвижных, микроаэрофильных бактерий. Род Lactobacillus относится к классу Bacilli, отряду Lactobacillales, семейству Lactobacil-laceae [1]. Лактобациллы составляют незначительную часть микробиоты кишечника взрослого человека, приблизительно 0.01—0.6% от всех обитателей желудочно-кишечного тракта. Преобладающими видами являются: L. gasseri, L. crispatus, L. salivarius, L. ruminis, L. acidophilus, L. fermentum, L. casei, L. rhamnosus, L. johnsonii, L. plantarum, L. brevis, L. delbrueckii, L. curvatus и L. sakei [2]. Количество лактобацилл, обнаруживаемое у новорожденных, составляет примерно 105 КОЕ в 1 грамме фекалий, в то время как у младенцев в возрасте от одного месяца это количество колеблется от 106 до 108 КОЕ/г. Большая часть выделяемых фекальных лактобацилл принадлежит к видам L. salivarius, L. rhamnosus и L. paracasei [2]. Молочнокислые лактобациллы — важный биотехнологический объект, они используются в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания (йогурт, простокваша, ряженка и
сыры), некоторые виды лактобацилл (обладающие пробиотическими свойствами) используются в составе лекарственных пробиотических препаратов, биологически активных добавок, продуктов функционального питания для человека и кормовых добавок для животных.
Цель данного исследования — изучение с использованием комплекса микробиологических и молекулярно-биологических методик производственных штаммов бактерий рода Lactobacillus, на протяжении ряда десятилетий используемых в РФ в качестве заквасок в различных биотехнологических процессах получения пищевых продуктов и фармацевтических препаратов, для уточнения их систематического положения и изучения биохимических характеристик.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы и условия культивирования
В работе исследовались 13 штаммов бактерий рода Lactobacillus (из коллекции ГКНМ ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского), выделенных из содержимого кишечника здоровых людей.
Таблица 1. Штаммы Lactobacillus, использованные в работе, источник выделения (коллекция), таксономическая принадлежность, установленная ранее, данные о молекулярно-генетической идентификации, полученные в данном исследовании
№ по порядку Название штамма Источник выделения* Ранняя идентификация на основании микробиологических данных Идентификация на основании данных строения гена 16S рРНК (в настоящем исследовании) Идентификатор последовательности гена (GI) в базе данных Genbank Сходство между последовательностями, %
1 CS 396 Содержимое кишечника здорового взрослого человека L. plantarum L. plantarum L. plantarum IMAU20020 (FJ844949.1) 99
2 8Р-А3 Вагина женщины, Эстония L. plantarum L. plantarum L. plantarum TC110 (EU074833.1) 99
3 90ТС-4 Растительное происхождение, Эстония L. fermentum L. plantarum L. plantarum IMAU20020 FJ844949.1) 98
4 ГКНМ 101 Содержимое кишечника здорового взрослого человека L. delbrueckii L. plantarum L. plantarum b2 (FJ227315.1) 97
5 Er 317/ 402 НАРИНЭ Содержимое кишечника здорового взрослого человека, Армения L. acidophilus L. helveticus L. helveticus ATCC 15009 (AF429509.1) 99
6 100 аш Содержимое кишечника здорового взрослого человека L. acidophilus L. helveticus L. helveticus DSM 20075 (AM113779.1) 99
7 NK-1 Содержимое кишечника здорового взрослого человека L. acidophilus L. helveticus L. helveticus IMAU20111 (FJ845009.1) 99
8 NNIE Содержимое кишечника здорового взрослого человека L. acidophilus L. helveticus L. helveticus DSM 20075 (AM113779.1) 99
9 ГКНМ 23 л1 Содержимое кишечника здорового взрослого человека L. brevis L. casei L. paracasei MH74 (FJ542303.1) 99
10 ГКНМ 577 Содержимое кишечника здорового взрослого человека L. casei L. casei L. paracasei MH71 (FJ542302.1) 99
11 КэШ24 Содержимое кишечника здорового взрослого человека L. acidophilus L. casei L. casei ATCC 27139 (EU670679.1) 99
12 421-2 Содержимое кишечника здорового взрослого человека L. plantarum L. rhamnosus L. rhamnosus MH22 (FJ409226.1) 99
13 ГКНМ 526 Содержимое кишечника здорового взрослого человека L. delbrueckii L. fermentum L. fermentum LB21 ( EU407607.1) 99
* Коллекция МНИИЭМ им. ГН. Габричевского.
РЕКЛАССИФИКАЦИЯ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ КУЛЬТУР
1487
Список всех штаммов, использованных в работе, а также источник их выделения приведены в табл. 1. Культуры всех штаммов выращивали в жидкой и на агаризованной среде МРС (производства "Hi-Media", Индия) в термостате при 37 ± 0.5°С в течение 24—48 ч. При выращивании бактерий на плотных питательных средах применяли анаэро-статы и газпаки фирмы "Био Мерье", обеспечивающие атмосферу, содержащую 10% СО2.
Биохимическая идентификация штаммов на основании ферментации углеводов
Идентификация проводилась с использованием тест-системы API-50CHL ("Био Мерье", Франция), позволяющей оценивать ферментативную активность 50 субстратов, и программного обеспечения к ней API WEB, согласно инструкции к набору, и АНАЭРОТЕСТА-23 производства "Pliva Lachema" (Чехия).
Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Гены 16S рРНК амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров 27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1492r (GGT-TACCTTGTTACGACTT) [3]. Каждую реакцию проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 0.5 мкг хромосомной ДНК, по 20 пмоль праймеров, 200 мкМ каждого dNTP, 1.5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl (pH 8.8) и 1.25 единицы активности 7а#-полимеразы. Реакцию проводили в амплификаторе Omn-E фирмы "Hy-baid". Сначала образцы ДНК подвергали денатурации при 94°С в течение 5 мин. Затем проводили 35 циклов, включающих денатурацию ДНК при 94°С в течение 30 с, отжиг праймеров при температуре 55°С в течение 40 с и полимеразную реакцию в течение 1.0 мин. Заключительный этап элонгации проводили при 72°С в течение 4 мин. Праймеры синтезировали в фирме "Синтол". В работе использовали реактивы фирмы "Fermentas".
Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК
С целью идентификации видовой принадлежности исследуемые последовательности ДНК анализировали на сходство с известными последовательностями генов 16S рРНК в базе данных GenBank с помошью программы BLASTN (ht-tp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) [4]. Идентичность последовательностей устанавливали на основе статистической значимости совпадений последовательностей. Дополнительный анализ последовательностей проводили с помощью их выравнивания с использованием программы Clustal X (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/in-dex.html).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация лактобацилл на основании
биохимических параметров, определяемых с использованием теста API 50 CHL
В табл. 2 приведены результаты определения способности изучаемых штаммов ферментировать различные (49) углеводные субстраты. В ходе проведения этого исследования нами дополнительно были исследованы разрешающие способности тест-систем API-50CHL и АНАЭРОТЕСТ-23 (данные в таблице не приведены). По мнению ряда исследователей, минимальный состав ингредиентов, необходимый для идентификации молочнокислых лактобацилл, следующий: глюкоза, салицин, целлобиоза, мелибиоза, манноза, сахароза, лактоза, трегалоза, манит, эскулин, галактоза, мелецитоза, арабиноза, сорбит, мальтоза, ксилоза, рамноза, фруктоза. Выбранные нами тест-системы наиболее приближены по составу активных ингредиентов к этому перечню. В составе АНАЭРОТЕСТ-23 нет только углевода ме-либиозы. Данные, полученные при использовании тест-систем АНАЭРОТЕСТ-23 и API-50CHL, согласуются между собой. В состав тест-системы API-50 CHL входят также другие активные компоненты (отсутствующие в АНАЭРОТЕ-СТЕ-23): инулин, метил-aD-маннопиранозид, метил-aD-глюкопиранозид, N-ацетилглюкоза-мин, амагдалин, арбутин, раффиноза, D-турано-за, D-тагатоза, D-арабит, данные о ферментации которых позволяют различать штаммы внутри вида.
Как видно из представленных в таблице результатов, четыре штамма, ранее отнесенные к видам L. аcidophilus
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.