научная статья по теме РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЕРОКСИДАЗА ХРЕНА: ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В АНАЛИТИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ (ОБЗОР) Химия

Текст научной статьи на тему «РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЕРОКСИДАЗА ХРЕНА: ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В АНАЛИТИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ (ОБЗОР)»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 4, с. 480 - 488

УДК 577.112;57.083.3;541.138

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЕРОКСИДАЗА ХРЕНА: ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В АНАЛИТИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ

Обзор

© 2015 В.Г. Григоренко1*, И.П. Андреева1, М.Ю. Рубцова1, А.М. Егоров12

1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)939-2742,

электронная почта: vitaly.grigorenko@gmail.com

2 Российская медицинская академия постдипломного образования,

кафедра микробиологии, 125993 Москва

Поступила в редакцию 14.11.14 После доработки 09.12.14

Пероксидаза хрена — важный фермент в био- и иммунохимическом анализе. Новые подходы к функциональной экспрессии гена пероксидазы в клетках Escherichia coli и последующему рефолдингу дали возможность получать рекомбинантный фермент, сравнимый по своим спектральным и каталитическим характеристикам с нативной растительной пероксидазой. Генно-инженерные подходы открыли новые перспективы в получении рекомбинантных конъюгатов пероксидазы как с антигенами, так и с Fab-фрагментами антител. Настоящий обзор посвящен использованию рекомбинантной пероксидазы хрена в качестве фермента-маркера в иммуноферментном анализе, а также в амперометрических сенсорах, основанных на прямом переносе электронов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: пероксидаза хрена, рекомбинантный конъюгат, амперометрический биосенсор.

Изофермент С пероксидазы хрена (ПХ, КФ 1.11.1.7) — широко распространенный в растениях, гем- и Са2+-содержащий фермент, является представителем семейства растительных пе-роксидаз [1—3], которые катализируют одноэлект-ронное окисление различных органических и неорганических субстратов пероксидом водорода. Растительные пероксидазы нашли применение в различных биотехнологических процессах, таких как биоотбеливание, утилизация органических соединений (фенолы, красители, лигнин), образующихся в ряде производств и др., тогда как пероксидаза хрена широко используется в аналитической биохимии и биотехнологии в качестве фермента-маркера для им-мунохимического определения антител, ДНК и низкомолекулярных соединений. Благодаря широкой субстратной специфичности, высокой

Принятые сокращения: ПХ — пероксидаза хрена; рПХ — рекомбинантная ПХ; ЭП — электронный перенос; ЛО — Ь-лизин-а-оксидаза; БСЖК — белок, связывающий жирные кислоты; ИФА — иммуноферментный анализ; ОИМ — острый инфаркт миокарда.

* Адресат для корреспонденции.

каталитической активности и стабильности, ПХ нашла огромное применение в био- и иммуно-сенсорах, хемилюминесцентной, флуоресцентной и электрохимической системах детекции, в ДНК- и белковых микрочипах с колориметрической детекцией [4—8].

Успехи в гетерологической экспрессии гена пероксидазы и установление кристаллической структуры ПХ открыли новые возможности для изучения структурно-функциональных закономерностей с помощью методов генной инженерии. Главной проблемой при экспрессии этого белка является его сложная структура: это гли-копротеин, содержащий в активном центре гем. Существует несколько способов экспрессии гена ПХ. Так, система экспрессии в бакуловирусах позволила получать рекомбинантный фермент в растворимой активной и гликозилированной форме [9]. Однако эта система из-за трудоемкости, сложности и дороговизны не нашла столь широкого распространения по сравнению с экспрессией в клетках E. coli. Экспрессия ПХ в дрожжах позволила получать фермент в активной растворимой форме, но с очень низким выходом [10].

Для получения рекомбинантной ПХ (рПХ) дикого типа, а также ее мутантных форм в основном используется система экспрессии в клетках E. coli [11, 12]. Рекомбинантная ПХ синтезируется в цитоплазме клеток E. coli в нерастворимой, неактивной форме в телах включения и содержит только следовые количества гема. Процесс рефолдинга и реактивации апоперок-сидазы простетической группой гема является сложной многоступенчатой задачей, поскольку молекула белка содержит четыре дисульфидные связи и два Ca^-иона. Кроме того, растительный фермент содержит 8 сайтов гликозилирова-ния (18% углеводов по массе). Ранее была установлена кристаллическая структура рПХ и было показано, что молекула белка состоит из двух доменов, состоящих в общей сложности из десяти а-спиралей [13].

Одним из факторов, приводящих к образованию тел включения в случае гетерологической экспрессии рекомбинантных белков с дисуль-фидными связями в клетках E. coli, является наличие активной системы поддержания восстанавливающего потенциала цитоплазмы, что препятствует правильному образованию дисуль-фидных связей и формированию нативной кон-формации таких белков [14]. В качестве альтернативного подхода для получения рекомбинант-ного белка в растворимой активной форме был выбран метод экспрессии в бактериальную периплазму, где окислительный потенциал способствует формированию стабильных дисульфид-ных связей. Для этой цели был создан экспрес-сионный вектор, кодирующий ПХ и сигнальный пептид на ^-конце. После транслокации сигнальный пептид удаляется, и образуется правильно сформированная молекула целевого белка с дисульфидными связями. Этот подход был успешно использован для получения растворимого активного рекомбинантного фермента рПХ, но с довольно низким выходом (~0,5 мг на 1 л культуры клеток E. coli) [15].

Для аналитического применения рПХ, например, в биосенсорах, необходим более эффективный и технологичный способ получения ре-комбинантного фермента. Введение гексагисти-диновой последовательности (6 х His) в С-кон-цевую область ПХ дало возможность проводить выделение фермента с помощью металлохелат-ной хроматографии и значительно облегчить процессы реактивации и очистки рПХ из тел включения. Кроме того, в три раза увеличивается выход рекомбинантного препарата, в частности, за счет эффективного выделения рПХ из сильно разбавленных растворов среды для ре-фолдинга [15]. Сравнительно высокий выход и высокая удельная активность рекомбинантного

фермента, полученного с использованием разработанного протокола рефолдинга, позволили получать достаточное количество рекомбинант-ного фермента (~10 мг из 1 л культуры клеток) для разработки биосенсоров, основанных на прямом переносе электронов (ЭП) с электрода на иммобилизованную рекомбинантную ПХ [4, 6], а также для улучшения чувствительности сенсоров, основанных на реакции усиленной хемилюминесценции [7].

БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ ПХ

Пероксидаза, иммобилизованная на электроде и способная участвовать в прямом ЭП, позволяет создать безмедиаторный биосенсор для определения как пероксидов, так и многих органических соединений, дающих пероксиды при окислении соответствующими оксидазами (глюкозоксидазой, лизин-оксидазой и др.). Однако в отсутствие медиатора эффективность прямого ЭП в системе золотой электрод-ПХ чрезвычайно низка [4, 5]. Наиболее вероятной причиной этого является большое расстояние между поверхностью электрода и активным центром ПХ из-за того, что растительный фермент гликозилирован и/или из-за неоптимальной ориентации молекулы на поверхности электрода. Также одной из основных проблем является прочность адсорбции белковой молекулы на поверхности золотого электрода. Mетод ковалентной иммобилизации посредством специальных химических сшивок приводит к увеличению расстояния между активным центром фермента и электродом, затрудняя прямой ЭП. Известные в настоящий момент способы иммобилизации биомолекул, приводящие к ЭП, сводятся к прочной хемосорбции ряда функциональных групп на поверхности золота [4, 5].

Методы генной инженерии позволили получать рекомбинантную ПХ и направленно изменять поверхность молекулы ПХ путем введения аминокислотных остатков (цистеина, гистидина), содержащих «удобные» функциональные группы для осуществления ориентированной иммобилизации фермента [15]. Золотые электроды, модифицированные рекомбинантными формами ПХ, проявляли высокий и стабильный амперометри-ческий отклик в реакции биокаталитического восстановления пероксида водорода вследствие прямого электронного переноса между ПХ и электродом и являлись перспективными для разработки биосенсоров безмедиаторного типа [6].

Сочетание рПХ с L-лизин-a-оксидазой (ЛО), которая обладает большой каталитической ак-

тивностью в реакции восстановления пероксида водорода, позволило разработать безмедиатор-ный биферментный биосенсор на L-лизин, который может работать при умеренных значениях потенциала (от 0 до —50 мВ) в том случае, если прямой ЭП между поверхностью электрода и активным центром фермента может быть осуществлен (рис. 1). В этом случае концентрация L-лизина пропорциональна концентрации пероксида водорода, который выделяется в процессе его ферментативного окисления. Был разработан амперометрический биферментный биосенсор для определения L-лизина, основанный на ЛО (класс оксидоредуктаз, КФ 1.4.3.14, из Trichooderma viride) и рПХ с 6 х His на С-кон-це (СШ8рПХ), физически соиммобилизованных на поверхности золотых поликристаллических электродов. Эффективный прямой ЭП между поверхностью золотого электрода и иммобилизованной рекомбинантной ПХ позволил осуществить безмедиаторное определение пероксида водорода, образующегося в результате ферментативного окисления L-лизина в режиме остановленного потока (рис. 2). Предел обнаружения L-лизина составил 1 мкМ, чувствительность определения — 0,03 А см-2 М-1 при —50 мВ относительно хлорсеребряного электрода сравнения [4—6].

РЕКОМБИНАНТНЫЕ КОНЪЮГАТЫ В АНАЛИЗЕ

Пероксидаза хрена — один из наиболее широко применяемых ферментов-маркеров в иммунодиагностике. Для высокочувствительных

методов иммуноферментного анализа (ИФА) необходимы конъюгаты ферментов-маркеров с антигенами или антителами. Однако все химические методы получения конъюгатов, как правило, приводят к частичной инактивации фермента и гетерогенности конъюгатов, что оказывает влияние на воспроизводимость, специфичность и чувствительность анализа. С развитием генной инженерии появилась возможность получать рекомбинантные конъюгаты с белковыми антигенами или антителами, представляющие собой химерные белки, в которых объединены структурные части как фермента-маркера, так и антигена/антител

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком