РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 1, с. 23-29
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ АНТИТЕЛА, БЛОКИРУЮЩИЕ БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА
© 2009 г. Г.А. Ефимов*, О.А. Вахрушева**, А.Ю. Сазыкин**, И.А. Муфазалов**, А.А. Круглов*, Д.В. Купраш*, С.А. Недоспасов* **
* Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия;
** Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва, Россия
Поступила: 15.01.09 г. Принята: 02.02.09 г.
На основе клонированных ДНК последовательностей высокоаффинного блокирующего мышиного моноклонального антитела против фактора некроза опухоли (ФНО) человека получено рекомбинантное одноцепочечное антитело аЬТ-2. ЛЬТ-2, молекулярной массой 28 кД, сохраняет способность блокировать цитотоксическую активность ФНО в биологических тестах, что в сочетании с его малыми размерами и простотой экспрессии делает его пригодным для дальнейшей биоинженерии на его основе биспецифичных блокаторов ФНО.
Ключевые слова: ингибиторы ФНО, блокаторы ФНО, биспецифические блокаторы
ВВЕДЕНИЕ
Фактор некроза опухоли (ФНО), цитокин широкого спектра действия, играет важнейшую роль в формировании иммунного ответа и, с другой стороны, является одним из ключевых элементов патогенеза многих аутоиммунных заболеваний. Патогенный ФНО был обнаружен в синовиальной жидкости пациентов, страдающих ревматоидным артритом (РА) [1]. В дальнейшем роль ФНО подтвердилась в исследованиях модельных аутоиммунных заболеваний у лабораторных животных [2]. Терапия, основанная на блокировке ФНО, оказалась чрезвычайно успешной при лечении РА [3, 4]. В настоящее время целый ряд блокато-ров ФНО успешно прошел клинические испытания [5 — 7]. Их применение одобрено не только для РА, но и для болезни Бехтерева, псориаза, псориатического артрита, болезни Крона, язвенного колита и некоторых других аутоиммунных заболеваний, в том числе и в России [8].
Адрес: 119991 Москва, ул. Вавилова, 32, ИМБ им. Энгельгардта РАН. E-mail: grigory@efimov.info; sergei.nedospasov@googlemail.com
С другой стороны, блокировка ФНО связана с риском нежелательных побочных эффектов, которые обусловлены важными природными функциями ФНО в развитии иммунного ответа. В частности, терапия ингибиторами ФНО может приводить к реактивации латентного туберкулеза [9], развитию фармакогенной волчанки [10], повышению вероятности возникновения лимфом [11], ухудшению симптоматики ишемической болезни сердца [12]. В связи с этим, существует необходимость создания новых блокаторов ФНО, которые могли бы блокировать его действие преимущественно в очаге воспаления, оставляя защитные функции цитокина в остальном организме интактными. Несмотря на обилие различных новых блокаторов ФНО в доклинических и клинических исследованиях [13 — 15], шаги в этом направлении до настоящего времени не предпринимались. Данная работа ставила своей целью создание небольшого по размерам белкового агента, эффективно блокирующего ФНО. Такой блокатор может в дальнейшем послужить субъединицей в биоинженерии биспецифических ингибиторов ФНО с направленным действием.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Измерение биологической активности антитела F10
Измерения биологической активности мышиного моноклонального антитела F10 и сравнение его эффективности блокировки ФНО с эффективностью применяемых в клинике препаратов: инфликсимабом и этанерцептом проводились:
а) На культуре мышиных фибробластов линий L929 по протоколу, аналогичному описанному ранее [16]. Кратко: к монослою L929 клеток в 96-луночные планшеты добавлялся рекомбинантный ФНО человека (чФНО) и Актиномицин Д маннитол (Sigma A5156) в постоянной концентрации (охарактеризованной ранее как вызывающей гибель 95% клеток) 20 нг/мл и 4 мкг/мл соответственно, а также блокаторы чФНО, в т.ч. антитела F10, в убывающих разведениях. После инкубации в течение 24 ч к клеткам добавлялся раствор MTT (Sigma M5655) до конечной концентрации 4 мкг/мл 16 часов спустя кристаллы формазана солюбилизировались 10% раствором додецилсульфата натрия в диметилсульфоксиде, после чего оптическая активность измерялась на микропланшетном фотометре при длине волны 540 нм с референсным значением 492 нм. Значения оптической плотности были пересчитаны на количество живых клеток.
б) В живой системе. Мышей генотипа ФНО -/- [17] внутрибрюшинно инъецировали различными дозами (10, 20, 50, 100, 200 и 500 нг/г веса) антитела F10 и инфликсимаба, а спустя 30 минут внутрибрюшинно вводили растворы D-галактозамина (Sigma G1639) и рекомбинантный чФНО в количестве 1 мг/г и 20 нг/г веса соответственно (ранее эти дозы были охарактеризованы нами как летальные для 100% мышей). В течение двух недель за мышами велось наблюдение, после чего они были забиты.
Vh домен GGGGSGGGGSGGGGS
Получение Fаb-фрагмента антител F10
Очищенный препарат моноклональных мышиных антител Б10 был подвергнут про-теолизу с помощью папаина по стандартному протоколу [18]. К 5 мг антител Б10 добавляли 200 мкг лиофилизированного папаина (Б1дша Р4762). Протеолиз проводился в реакционном буфере, приготовленном на основе стандартного фосфатно-солевого буфера и дополнительно содержащего: 10 мМ ЭДТА (ЛшгеБсо ОВ105), 25 мМ цистеин-гидрохлорида (Б1дша С7880) при рН = 7,0; в течение 4-х часов при температуре 37°С. Для остановки реакции к смеси добавляли йодоацемид (Б1дша 16125) до конечной концентрации 5,5 мг/мл. Затем реакционная смесь была подвергнута диа-фильтрации в микрофильтрационной ячейке (Лшюоп) против буфера, содержащего 100 мМ 1-замещенного фосфата натрия (ЛшгеБсо О823) и 150 мМ хлорида натрия (ЛшгеБСО 0241) при рН = 7,2. Полученный препарат, являющийся смесью БаЪ-фрагментов, Бс-фрагментов и папаина, был проанализирован с помощью денатурирующего электрофореза, чтобы исключить неполный протеолиз. Очистку БаЪ-фрагмента проводили с помощью гранулированной агарозы, конъюгированной с протеином^ (Р1егсе 89928) по протоколу производителя. Гомогенность полученного препарата проверяли с помощью денатурирующего электрофореза.
Конструирование и экспрессия одноцепочечного антитела ahT-2
Гены вариабельных участков тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела Б10 были проклонированы нами ранее [19]. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) эти гены были соединены в генетическую конструкцию (рис. 1), включающую в себя С-концевой гистиди-новый гексамер, участок узнавания тром-биновой протеазы и гибкий глицин-серино-вый линкер. ПЦР проводилась с четырьмя
VI домен ЬУРЯСБ НННННН
Гибкий линкер Сайт разрезания Гистидиновый
тромбиновой гексамер
протеазы
Рис. 1. Схема одноцепочечного антитела ahT-2
Вариабельные участки тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела Б10 разделены пептидным линкером состава ^1у48ег)3. На С конце расположен гистидиновый гексамер, отделенный от гена вариабельной части тяжелой цепи сайтом узнавания тромбиновой протеазы.
Рис. 2. Схема ПЦР, собирающей конструкцию одноцепочечного антитела
Схема ПЦР для сборки генетической конструкции одноцепочечного антитела аИ*-2. На схеме изображены вариабельные фрагменты тяжелой и легкой цепей, а также олигонуклетиды Н_^ог(№о), L_rev(Xho), L_for и Н_геу.
олигонуклеотидами- праймерами:Н_1:ог(№о), L_rev(Xho), L_for и H_rev. H_for(Nco) своим 3' концом комплементарен 5' концу вариабельной части тяжелой цепи, а на 5' конце содержит сайт эндонуклеазы рестрикции NcoI. L_rev(Xho) комплементарен 3' концу вариабельной части легкой цепи, а на своем 5' конце находится сайт рестриктазы XhoI и последовательность, кодирующая сайт тромбиновой протеазы. Олигонуклеотиды L_for и H_rev комплементарны вариабельным фрагментам легкой и тяжелой цепей соответственно, а за счёт взаимно комплементарных участков образуют двухцепочечную последовательность, кодирующую глицин-сериновый линкер. Схема ПЦР реакции приведена на рис. 2 ПЦР с использованием полимеразы Phusion (Finnzymes, Финляндия) проводили по протоколу фирмы-производителя. Олигонуклеотиды L_for и H_rev были добавлены в реакционную смесь в концентрации 100 раз меньшей, чем остальные два олигонуклеотида. Таким образом в течение первых нескольких циклов образовывались два коротких продукта, которые в дальнейшем, когда праймеры L_for и H_rev истощались, отжигались сами на себя, производя полноразмерный фрагмент. Продукт ПЦР был подвергнут двойной рестрикции (NcoI и XhoI) и клонирован в экспресси-онный вектор pET-22(b), которым затем были трансформированы клетки штамма BL21(DE3) (Novagen). Наращивание бактериальной культуры до оптической плотности 1.0 (при длине волны 600 нм.) проводили в бактериальном инкубаторе, в стеклянных колбах объемом 2 л, содержащих 200 мл среды 2xTY при 27°С. Для индукции транскрипции к среде добавляли Изопропил-бета^-тиогалактозид (Anatrace I1003) в конечной концентрации 0,2 мМ и сахарозу в конечной концентрации 0,4 мМ для создания осмотического давления, увеличивающего выход растворимых одноцепочечных антител. Индукция проводилась в течение трех часов при 27°С. Бактериальная биомасса осаждалась центрифугированием при 4000 g
в течение 30 мин. при 4°С на центрифуге Eppendorf 5810 R. Осадок от 200 мл среды был собран вместе и ресуспендирован в 30 мл ледяного буфера, содержащего 20% сахарозы, 30 мМ Трис (Amresco O497) и 1 мМ ЭДТА (Amresco 0B105) при pH = 8,0 и инкубирован в течение часа на льду при постоянном перемешивании. После этого было проведено второе центрифугирование в течение 20 мин. при 17000 g и 4°С. Полученный таким образом супернатант содержал периплазма-тическую фракцию. Периплазматическая фракция была диализована против буфера, содержащего 50 мМ фосфата натрия, 300 мМ хлорида натрия (Amresco 0241) и 10 мМ имидазола (Panreac), pH = 8,0 при 4°С.
Растворимый белок выделяли из пери-плазматической фракции и очищали с помощью металл-хелатной хроматографии по стандартному протоколу. Затем C-концевой гистидиновый гексамер удаляли протеоли-зом тромбиновой протеазой, конъюгиро-ванной с гранулированной агарозой (Sigma RECOMT). После этого проводили вторую металл-хелатную хроматографию для очистки препарата одноцепочечных антител
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.