ЩЦКЯШ БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2004, том 30, № 5. с. 481^486
ш
УДК 577.151.02:577.175.76:577.213.3
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ТИМОЗИН ах
© 2004 г. Р. С. Есипов#, А. И. Гуревич, В. Н. Степаненко, JI. А. Чупова, Д. В. Чувиковский, А. И. Мирошников
Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 ГСП, Москва, В-437,ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 24.11.2003 г. Принята к печати 15.12.2003 г.
Осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование в Escherichia coli искусственного гена, кодирующего тимозин о^. Сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая гибридный ген белка, в котором соединены аминокислотные последовательности тимозина at и интеина See VMA из Saccharomyces cerevisiae. Изучена экспрессия полученного гибридного гена в Е. coli, свойства образующегося гибридного белка и условия его неферментативного расщепления с образованием тимозина 0Ц.
Ключевые слова: тимозин ccj, гибрид тимозина et] с интеином, неферментативное расщепление гибридного белка.
ВВЕДЕНИЕ
Тимозин а! - один из более чем 30 низкомолекулярных пептидов (28 а.о.), содержащихся в тимусе [1], обладает мощной общей иммуностимулирующей активностью. Тимозин сц синтезируется в организме в виде предшественника, от которого затем отщепляется и подвергается /У-концевому ацетилированию. Однако установлено, что УУ-дезацетилтимозин о^ также проявляет полный спектр биологических активностей на-тивного пептида [2].
Тимозин а! является перспективным лекарственным препаратом и в настоящее время применяется для лечения различных бактериальных инфекций (в том числе резистентного к антибиотикам туберкулеза), вирусных заболеваний (гепатиты В и С), а также в качестве противоопухолевого средства [3].
В настоящее время тимозин «1 выделяют из тимуса теленка при помощи многостадийной хро-матографической очистки [4] или получают полным химическим синтезом. Значительно более перспективным представляется биотехнологический путь с использованием экспрессии рекомби-нантного гена в бактериях. Такой путь уже был неоднократно использован ранее для получения тимозина оц в составе различных гибридных белков. Еще в 1980 г. группой фирмы "ОепегПесЬ" был осуществлен микробиологический синтез ги-
Сокращения: ПЦР - полимеразная цепная реакция; ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография; ОТТ -дитиотреит; 1РТО - изопропил-(3-£-тиогалактозид; ТИА -трифторуксусная кислота; ГБ - гибридный белок.
"Автор для переписки (тел.; (095) 336-68-33; эл. почта: esipov@ibch.ru).
брида тимозина ОС) с ß-галактозидазой Escherichia coli [2]. Однако в таком гибриде доля пептида составляет менее 3%, что обесценивает высокий уровень экспрессии гибридного гена в клетках бактерий. Более целесообразным при конструировании гибрида явилось использование в качестве "носителя" небольшого по размерам белка-фактора некроза опухолей человека (TNF) [4, 5]. Однако во всех этих случаях основные трудности в процессе получения целевого пептида - тимозина а! - возникали при расщеплении гибридного белка, в результате которого, как правило, получение целевого полипептида происходило с малым выходом и сопровождалось образованием трудно отделяемых продуктов неспецифических реакций.
В этом отношении более перспективным представляется получение гибрида с интеином, белковым "интроном", способным к автокаталитическому сплайсингу, т.е. выщеплению из структуры предшественника и сопутствующему лиги-рованию N- и С-фланкирующих белковых фрагментов, так называемых экстеинов [6,7]. Механизм реакций, протекающих в /V- и С-концевых доменах интеина и приводящих к сплайсингу, приведен на рис. 16.
В своей работе мы использовали 1МРАСТ-сис-тему (Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag) фирмы "New English BioLabs", принципиальное отличие которой от других систем заключается в получении целевого белка без использования сериновых протеиназ и других факторов, способных расщеплять гибридный белок. В ней используется модифицированный ин-теин See VMA из Saccharomyces cerevisiae, содер-
Т7-промотер
/V-концевой экстенн
Посадка на хитиновую колонку и промывка
V
■т1
\ ram
N TL .■'.'■'..,•
/V-экстенн \ интеин Н
(б)
^ \ С-эксгекн
Су si
Индуцируемое тиольными реагентам« авток атаготгче ское расщепление
/V-концевой эксгеин (1.6 кДа)
ш Cys511
N-S-не ре эте р ификация
Н
S
Cysl
Asn510
С-концевое расщеплеиие
X
/
/
/
/V-конце вое
Cysl
NH2 Cys5U \ расщеплеиие
Cys511
О
HS
H,N
трансэтерификация
О
4 S.
HS С—1 + SH
нА..... "кля^т
Cysl
О
Cysl
Cysill
NH,
Расщепление пептидной связи с образованием сукцнюсмнда
HS v
ИЛ " С
Cys511
Cysl
5-/У-переэтсриф|гкация
Гидролиз сукцннимнда
Cysl
Cys511 Продукт сплайсинга
NH2 ОН
Рис. 1. Строение гибридного белка с интеином и механизм реакций его расщепления: (я) схема реакций при выделении тимозина ОС] на хитиновой колонке; (6) механизм реакций трансрасщепления гибридных белков с интеином.
жащий хитинсвязывающий домен, который позволяет легко отделять гибридный белок путем аффинной хроматографии (см. рис. 1а). В присутствии тиольных реагентов, таких, как дитиотре-ит, меркаптоэтанол или цистеин, гибридный белок способен к самопроизвольному сайт-специфичес-кому расщеплению, при котором образуется интеин, целевой белок и маленький фрагмент /У-экс-теина (около 1.6 кДа) (см. рис. 1).
Используя эту экспрессионную систему, мы клонировали искусственный ген тимозина а, в
векторе pTYB-11, включающем структуру интеи-на See VMA из S. cerevisiae.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При изучении механизма белкового сплайсинга, предполагаемая схема которого приведена на рис. 1 б, было найдено, что расщепление пептидной связи у iV-конца интеина (в большинстве случаев остатка Cysl или Serl, и реже-Thrl) индуцируют тиольные реагенты [8]. В этой реакции
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ТИМОЗИН а,
483
(а)
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Äsp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Rla-Glu-Äsn-OH TCC-GAT-GCT-GCG-GTG-GAC-ACA-TCC-TCT-GfiA-ftTT-ACA-ACG-ftAA-GAT-CTG-AAA-GfiA-AftG-AAA-GAÄ-GTT-GTG-GAA-GAG-GCT-GAG-AÄC
{б)
ВатШ Sapl ШтШП
т CGGGATCCGCTCTTCTAACTCCGATGCTGCGGTGGACACATCCTCTGARÄTTACAACGAAÄGATCTGAAÄGAAAAGAAAGAflGTTGTGGAAGAGGCTGÄGÄACTAAGCTTCCCG О') GCCCTAGGCGAGftAGATTGAGGCTACGACGCCACCTGTGTAGGAGACTTTAATGTTGCTTTCTAGACTTTCTTTTCTTTCTTCAACACCTTCTCCGACTCTTGATTCGAAGGGC
СС«ЗАТССССТСТТСТААСТ РгТУ1
ПГ-1 ТУ-2 ТУ-З ТУ-4
<5') СС(^ТСС(ЗСТСТТСТААСТСССАТССТСС ССТССАСАСАТССТСТСАААТТАСААСС АААСАТСТСАААСААААСАААСААСТТСТС СААСАСССТСАСААСТААССТТСССС <3') ССССТАЙСССАСААСАТТО АСССТАССАССССАССТСТСТАССАСА СТТТААТСТТбСТТТСТАСАСТТТС ТТТТСТТТСТТСААСАССТТСТС СОАСТСТТОАТТСОААСОСС ТУ-5 ТУ-6 ТУ-7 ТУ-8 ТУ-9
Рис. 2. Структура тимозина и его искусственного гена, (а) - аминокислотная последовательность тимозина о^ и нук-леотидная последовательность соответствующих кодонов в гене; (б) - структура искусственного гена тимозина 0Ц с соответствующими сайтами рестриктаз; (в) - схема синтеза искусственного гена тимозина с^.
iV-концевой участок интеина претерпевает перегруппировку, в которой Cysl превращается в тио-эфир, который в свою очередь атакуется нуклео-фильным реагентом (например, дитиотреитом), что и ведет к /V-концевому расщеплению.
С другой стороны, отщепление С-экстеиново-го фрагмента не нуждается в индукции каким-либо реагентом. Оно происходит спонтанно, но лишь в узких пределах температуры и рН среды. При этом находящийся на С-конце интеинового фрагмента остаток Asn (который чаще всего соседствует с остатком His) превращается в сукци-нимид [9]. Условия протекания последней реакции были детально изучены [10-13]. Оптимальным для нее является присутствие в соседнем с остатком Asn положении экстеинового фрагмента остатков Cys, Ser или Thr. Следует отметить, что те же самые аминокислотные остатки в положении 1 N-концевого участка интеина необходимы для расщепления Áf-терминальной пептидной связи и последующей реакции лигирования в процессе белкового сплайсинга [8]. Это обстоятельство служит причиной нежелательного образования продуктов сплайсинга уже при культивировании бактериального продуцента, которое существенно снижает выход целевого рекомбинантного белка.
Недавно было установлено, что на процесс сплайсинга существенное влияние оказывает присутствие некоторых ионов металлов; так, в присутствии хлорида цинка хелатирование иона цинка с интеином ингибирует процесс сплайсинга, а также реакцию гидролиза при /V-терминально м трансрасщеплении (т.е. при взаимодействии раздельно полученных частей молекулы одного и того же интеина) и спонтанную реакцию С-терминального трансрасщепления у интеина. Эффект ионов Zn2+ снимается в присутствии EDTA [12, 14].
Спонтанное трансрасщепление было обнаружено в структурах, содержащих в С-концевом экстеине остаток Cysl. Структуры, содержащие в С-концевом экстеине остаток Serl, в этом отношении ранее не были изучены. Поэтому тимозин а,, имеющий на /V-конце остаток Ser, кроме своей биологической значимости, представлял собой интересный объект для исследования механизма сплайсинга.
Аминокислотная последовательность тимозина а( и нуклеотидная последовательность соответствующих кодонов в гене приведены на рис. 2а. Искусственный ген тимозина а,, структура которого приведена на рис. 26, мы синтезировали из олигонуклеотидов TY-1 - TY-9 по приведенной на рис. 2в схеме, используя для ПЦР-амплификации праймеры PrTYl и TY-9. Полученный таким образом дуплекс после расщепления соответствующими рестриктазами ВатШ и Hindill лигировали с векторной плазмидой pBR322. Образовавшуюся плазмиду после клонирования в клетках Е. coli выделяли, расщепляли рестриктазами Sapl и EcoRl, полученный при этом Sapl/EcoRl-фрагмент с геном тимозина oq лигировали с векторной плазмидой pTYB-11 и образовавшуюся экспрессионную плазмиду pIntTim3 клонировали в клетках Е. coli ER2566. Полученный при этом продуцент Е. coli ER2566/pIntTim3 культивировали при 37°С до оптического поглощения культуры 0.6-0.7, затем индуцировали IPTG и выращивали 14-16 ч при 14°С. При этом из лизата клеток удавалось получить гибридный белок (ГБ) в растворимой форм
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.