КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2009, том 54, № 6, с. 968-976
УДК 538.87.91.97
Посвящается памяти В.Л. Инденбома
РЕНТГЕНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА И МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКОВЫХ ПЛЕНОК НА ПОВЕРХНОСТИ ЖИДКОЙ СУБФАЗЫ
© 2009 г. С. И. Желудева, Н. Н. Новикова1, М. В. Ковальчук1, Н. Д. Степина,
ОТВ. Коновалов2, Э. А. Юрьева3
Институт кристаллографии РАН, Москва, Россия 1РНЦ "Курчатовский институт", Москва, Россия E-mail: nn_novikova@ns.crys.ras.ru 2Европейский центр синхротронного излучения (ESRF), Гренобль, Франция 3 МНИИпедиатрии и детской хирургии МЗ РФ, Москва, Россия Поступила в редакцию 08.06.2009 г.
Представлены результаты исследования белковых пленок на основе ферментов: щелочная фосфа-таза и глюкозаоксидаза, сформированных на поверхности жидкой субфазы. Экспериментальные исследования методом рентгенофлуоресцентных измерений в области полного внешнего отражения были проведены в Европейском центре синхротронного излучения ESRF (Гренобль, Франция). Впервые решалась задача изучения методом рентгенофлуоресцентных измерений процессов самоорганизации, протекающих в белковых системах на поверхности жидкой субфазы, в условиях, когда белковые молекулы сохраняют свою подвижность.
PACS: 68.18.-g, 68.47.Pe; 78.70.En
ВВЕДЕНИЕ
Создание новых методов формирования и изучения свойств высокоорганизованных белковых систем представляет собой одно из важнейших направлений научных разработок в области нанотехнологий. Упорядоченные биоорганические слоистые наноструктуры приобретают все большее значение как для фундаментальных исследований процессов функционирования белковых молекул, так и для различных биотехнологических применений, к числу которых в первую очередь относится использование белковых пленок в качестве активных элементов биосенсоров.
Особый интерес к исследованию упорядоченных белково-липидных пленок связан с тем, что по своему составу и морфологии эти системы представляют собой адекватную модель биологических мембран. Такие исследования позволяют получать информацию о структурно-функциональном состоянии мембранных моделей на молекулярном уровне и могут быть эффективно использованы для решения широкого круга задач, связанных с медицинской диагностикой и биофизическими исследованиями: получение данных о молекулярной организации белково-ли-
пидных моделей клеточных мембран, изучение механизмов повреждения клеточных мембран при патологическом воздействии на клетку, контроль эффективности и безопасности действия новых лекарственных препаратов in vitro и т.п.
Новые перспективы для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии и медицины открывает изучение белково-липид-ных пленок на поверхности жидкой субфазы, когда не нарушается нативная конформация белковых молекул, а следовательно, сохраняются их биологические функции. Это дает принципиальную возможность моделировать различные биофизические и биохимические процессы, протекающие в биологически активных функционирующих мембранах. Дополнительные преимущества исследования белково-липидных слоев на жидкой субфазе связаны с возможностью моделировать условия функционирования биомембран в живых клетках, изменяя химические и физические свойства субфазы.
Дальнейшее расширение границ применения органических и биоорганических слоистых наноструктур в сфере фундаментальных и прикладных исследований тесно связано с развитием новых физических методик для характеризации объек-
тов, имеющих наноразмерную организацию. К числу наиболее перспективных современных структурно--чувствительных методов диагностики тонкопленочных систем относятся рентгено-флуоресцентные методики, дающие спектрально-селективную структурную информацию.
Метод стоячих рентгеновских волн (СРВ) привлек большое внимание исследователей благодаря уникальным возможностям на основе объединения прецизионных рентгенодифракционных и спектроскопических исследований получить новый инструмент — ангстремную шкалу для изучения структуры неоднородно-периодических систем субнанометрового диапазона. В рамках этого метода наряду с рентгеновским отражением регистрируется выход вторичных излучений, возникающих при неупругом рассеянии рентгеновских лучей в условиях полного внешнего отражения (ПВО) или брэговской дифракции. Анализ угловых зависимостей интенсивности характеристического флуоресцентного излучения, возбужденного первичным пучком от определенных атомов, и модулированного сложным распределением электромагнитного волнового поля (стоячие рентгеновские волны и эванесцентная волна) позволяет напрямую определять местоположение атома-источника вторичного излучения в слоистых структурах [1—4].
Важным шагом в развитии рентгенофлуорес-центных методик является использование этих методов для исследования белково-липидных слоев на жидкой субфазе [5, 6]. Такие измерения позволят получить уникальную информацию о молекулярной организации и элементном составе белково-липидных моделей клеточных мембран в условиях, наиболее приближенных к естественным условиям их функционирования. Несмотря на огромный потенциал спектрально -селективных рентгеновских методик, работы по изучению органических слоев на жидкости методом рентгенофлуоресцентных измерений носят единичный характер. Представленные в настоящей работе исследования белковых пленок на жидкой субфазе с помощью рентгенофлуорес-центных измерений были проведены впервые.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Формирование белковых слоев на поверхности жидкости
Приготовление белково-липидной пленки на основе щелочной фосфатазы. В работе использовали препарат белка щелочной фосфатазы (Sigma) в виде лиофилизованного порошка, содержащего 90% белка с активностью 100—300 DEA ед/мл. Фосфатидилинозитол растворяли в воде 1.25 мг/мл при интенсивном встряхивании. Для получения белково-липидной смеси раствор фосфатидили-
нозитола добавляли к водному раствору белка из расчета 27 мкл раствора фосфатидилинозитола на 250 мкг белка, мольное отношение 1 : 20. Белко-во-липидную смесь встряхивали в течение 10 мин. Раствор 1,2 дипальмитоил-от-глицерофосфат-З-фосфатидилхолин (DPPC) в хлороформе концентрации 0.3 мг/мл наносили на субфазу TRIS рН = 8.3 (подкисление раствора проводили соляной кислотой). Монослой поджимали со скоростью 8 мм/мин до поверхностного давления 0.012 Н/м, затем слой разжимали и вводили под монослой 200 мкл смеси щелочной фосфатазы и фосфатидилинозитола. Монослой выдерживали 30 мин и опять поджимали слой до 0.012 Н/м. Снова разжимали, добавляли 300 мкл смеси щелочной фосфатазы и фосфатидилинозитола. Еще раз выдерживали слой в течение 30 мин и поджимали его уже до давления 0.03 Н/м.
Приготовление белковой пленки на основе глюко-заоксидазы. Использовали препарат глюкозаокси-дазы (Sigma) в виде лиофилизованного порошка, содержащего более 60% белка с активностью 2000—10000 ед/г. Водный раствор глюкозаоксида-зы концентрации 8 мг/л выдерживали в течение 12 ч, а затем наливали в Ленгмюровскую ванну. Раствор бегеновой кислоты в хлороформе концентрации 0.5 мг/мл наносили на субфазу. Через 20 мин монослой бегеновой кислоты поджимали со скоростью 8 мм/мин до поверхностного давления 0.02 Н/м. Перед началом измерений монослой выдерживали 40 мин.
В представленных в настоящей работе исследованиях для приготовления всех рабочих белковых растворов, а также буферных растворов субфазы была использована сверхчистая вода (сопротивление >18 МОм/см), полученная на установке MiHipore Corp.
Экспериментальные исследования с помощью рентгенофлуоресцентных измерений
Экспериментальные исследования белково-липидных пленок на поверхности жидкой субфазы методом стоячих рентгеновских волн проводили в Европейском Центре Синхротронного Излучения (Гренобль, Франция) на станции ID10B, оборудованной Ленгмюровской ванной с подвижным барьером. Поверхностное давление слоя поддерживалось постоянным в процессе измерений. Исследования проводились при комнатной температуре. Падающий и отраженный пучки лежали в вертикальной плоскости. Для мо-нохроматизации падающего пучка использовался двухкристальный монохроматор с алмазными кристаллами-монохроматорами. Пучок отклонялся от горизонтальной плоскости и направлялся на поверхность жидкости под заданным углом с помощью вращения отклоняющего кристалла (Ge) относительно падающего пучка. Отраженный от поверхности жидкости рентгеновский пу-
а ^ 0.01
7 8 9 E, кэВ
Рис. 1. Характеристический спектр флуоресцентного излучения от белково-липидной пленки на основе смеси щелочной фосфатазы и фосфолипида фосфа-тидилинозитол.
1E-3 L_l
12 14
E, кэВ
Рис. 2. Характеристический спектр флуоресцентного излучения от белковой пленки на основе глюкозаок-сидазы.
чок регистрировался сцинцилляционным Nal счетчиком. Флуоресцентный сигнал регистрировался с помощью детектора ROENTEC, который располагался над поверхностью жидкости. Характеристический спектр флуоресцентного излучения записывался для каждого угла падения. Энергия падающего пучка составляла 13.3 кэВ для измерений пленки на основе щелочной фосфатазы и 22 кэВ для измерений пленки на основе глюкозаоксидазы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение элементного состава белковых пленок на жидкой субфазе
На рис. 1 представлен типичный спектр характеристического флуоресцентного излучения от белково-липидной пленки на основе щелочной фосфатазы, записанный при фиксированном угле падения рентгеновского пучка 0 < 0С (где 0С — критический угол ПВО для воды). Помимо наиболее интенсивного пика от аргона из окружающей атмосферы, на спектре четко различимы пики от ионов, присутствующих в самой пленке — это прежде всего сера, входящая в состав функциональных групп цистеина и метионина аминокислотных остатков белковых молекул, и цинк, присутствующий в активном центре металлофер-мента. Кроме того, хорошо виден пик от фосфора, который содержится в фосфатных группах полярных головок фосфолипидов DPPC и фосфа-тидилинозитола. На спектре также присутствует пик от хлора, входящего в состав водной субфазы. Следует особо отметить наличие на спектре интенсивных пиков от ионов металлов Fe и Ni (еще
раз подчеркнем, что для приготовления всех
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.