БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 2, с. 256 - 268
УДК 597.554.3:577.122.313
РЕОРГАНИЗАЦИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ФРАКЦИИ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ В ГОДОВОМ ЦИКЛЕ КАРПОВЫХ РЫБ*
© 2015 А.М. Андреева1**, Н.Е. Ламаш2 3, М.В. Серебрякова4, И.П. Рябцева1, В.В. Большаков1
1 Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 Борок Ярославской обл.; факс: +7(485)472-4042, электронная почта: aam@ibiw.yaroslavl.ru
2 Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, 690041 Владивосток; факс: +7(423)231-0900, электронная почта: inmarbio@mail.primorye.ru 3 Дальневосточный федеральный университет, 690922 Владивосток;
факс: +7(423)243-2315, электронная почта: rectorat@dvfu.ru 4 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: +7(495)939-0338, электронная почта: fxb@genebee.msu.su
Поступила в редакцию 21.08.14 После доработки 26.09.14
Анализ изменений в составе низкомолекулярной белковой фракции плазмы карповых рыб, проведенный с использованием различных электрофоретических методов, выявил их корреляцию с сезонными изменениями и приуроченными к ним репродуктивными ритмами рыб. Для выявления этих взаимосвязей у пресноводных и проходных карповых рыб использовали культивируемые виды, у которых были секвенированы геномы. Сходство в составе низкомолекулярных белковых фракций плазмы различных видов рыб позволило провести надежную идентификацию некоторых их белков. Результаты масс-спектрометрического анализа MALDI показали наличие в составе низкомолекулярной фракции белков у диких видов и культивируемых видов одних и тех же белков — гемопексинов, аполипопротеинов и ингибиторов протеиназ. Белки первых двух классов организованы в виде комплексов из белков-олигомеров. Стехиометрия этих комплексов меняется согласованно с сезонными и репродуктивными ритмами.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: рыбы, белки плазмы, масс-спектры, МАЛДИ.
Плазму крови считают одним из наиболее сложных образцов для исследования методами протеомики [1]. Помимо «истинных белков плазмы» — внеклеточных белков, «помеченных» после синтеза аминокислотной цепи сигнальным пептидом, она содержит в незначительном количестве и тканевые белки, попавшие в кровоток вследствие разрушения клеток [2]. Кроме того, в плазме обнаружены белки некоторых вирусов, бактерий и дрожжей [3]. Техника 2Б-элекг-рофореза позволила дифференцировать плазму на десятки белков [4, 5], в составе которых с помощью масс-спектрометрии МЛЬВ1 и 8БЬВ1 идентифицировано более тысячи полипептидов
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-236, 25.01.2015.
** Адресат для корреспонденции.
[6, 7]. При всем множестве белков в составе плазмы ее «истинные белки» у всех позвоночных группируются в электрофорезе в четыре основные фракции, обозначенные Тизелиусом [8] как альбумины, а-, в- и у-глобулины.
В протеоме плазмы рыб (как и человека) обнаружено около тысячи различных продуктов отдельных генов [9]. Интерес к нему обусловлен, прежде всего, принадлежностью рыб к низшим УеНгЬгМа. Именно в низших таксонах появились и сформировались основные белковые фракции плазмы, характерные для всех Уег1гЪга1а [10—13]. С другой стороны, интерес к протеому плазмы рыб обусловлен его динамичным характером. Динамика характерна и для протеома плазмы человека, проявляясь в широком размахе содержания отдельных белков [14], особенно, сывороточного альбумина, концентрация которого в плазме варьирует более чем на 10 поряд-
ков [1]. У рыб же вследствие их пойкилотермной природы динамика протеома плазмы должна проявляться не только в варьировании концентрации отдельных белков, но и, предположительно, в других закономерностях, отражающих ее согласованность с сезонными и приуроченными к ним репродуктивными ритмами.
Целью работы является исследование закономерностей изменения состава наиболее вариабельной низкомолекулярной белковой фракции плазмы — низкомолекулярной — в годовом цикле карповых рыб.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. В работе использовали рыб из отряда Cypriniformes, семейства Cyprinidae: 1) дикие виды — лещ Abramis brama, плотва Rutilus rutilus, синец Abramis ballerus, уклейка Alburnus alburnus, чехонь Pelecus cultratus, густера Blicca bjoerkna, серебряные караси Carassius auratus (р. Волга, Рыбинское вдхр.); красноперки рода Tribolodon — мелко- и крупночешуйная T. brandtii и T. hakonensis (Японское море, р. Раздольная); 2) культивируемые виды — карпы Cyprinus carpio (прудовая база Сунога ИБВВ РАН) и брахиданио рерио Danio rerio (аквариумы).
Получение сыворотки и плазмы крови рыб. Кровь отбирали из хвостовых сосудов рыб сразу после их отлова. Для получения сыворотки кровь отстаивали при 4°; для получения плазмы — собирали в пробирки с 1%-ным раствором (m/V) гепариноида, осевшие эритроциты удаляли центрифугированием при комнатной температуре в течение 10 мин при 14 000 g.
Стадии зрелости гонад и половые циклы рыб определяли по шкале зрелости половых продуктов, используемой в ихтиологической и рыбоводной практике [15].
Электрофоретические методы. НМ-фракцию оценивали по числу белков, их молекулярной массе MW, электрофоретической подвижности m белков и расположению в 7,5%-ном ПААГ в диск-электрофорезе.
Способ организации (мономер/олигомер) белков определяли по расположению, числу и мол. массе «пятен» белков в неденатурирующем 20-электрофорезе (2D-E) в градиенте концентраций 5—40% ПААГ и денатурирующем электрофорезе — в 11%-ном ПААГ с 8 М мочевиной [16] и 12,5%-ном Ds-Na-ПААГ в восстанавливающих условиях [17]. В первом направлении проводили диск-электрофорез в ПААГ [18, 19]: концентрация концентрирующего геля составила 3%, рН 6,9, разделяющего — 4,9%, рН 8,9. При постановке одномерного диск-электрофореза
использовали 3%-ный концентрирующий и 7,5%-ный разделяющий гели.
После электрофореза в неденатурирующих условиях и в ПААГ с мочевиной гели фиксировали 10%-ной ТХУ и после отмывания окрашивали красителем Coomassie R-250 — 0,01%-ным раствором, приготовленным на смеси этанол — уксусная кислота — вода в соотношении 10 : 1 : 30. После Ds-Na-электрофореза гели фиксировали 70%-ным изопропиловым спиртом и далее окрашивали красителем Coomassie R-250 — 0,04%-ным раствором, приготовленным на смеси изопро-панол — этанол — уксусная кислота — вода в соотношении 2 : 1 : 1 : 6, согласно прописи [17].
Если в градиенте ПААГ и ПААГ с мочевиной белок был представлен одним «пятном», его считали мономером; если несколькими «пятнами» в ПААГ с мочевиной, то олигомером, стабилизированным водородными связями. Если в ПААГ с мочевиной белок представлен меньшим количеством «пятен», чем в Ds-Na-ПААГ в восстанавливающих условиях, то считали, что белок состоит из нескольких полипептидных цепей, связанных S-S-связями.
В качестве маркеров молекулярной массы использовали полимеры сывороточного альбумина человека HSA (67, 134, 201, 268, 335 кДа) и овальбумина ОА (45, 90, 135 кДа) и PageRulerTM Prestained Protein Ladder Plus (11, 17, 28, 36, 55, 72, 95, 130, 250 кДа) («Fermentas», Литва). Ден-ситометрирование, расчет относительного содержания и MW белков проводили с помощью программы ONE-Dscan, Ver 1.31 («Scananalytic Inc.», США).
Масс-спектрометрия MALDI. Все операции по подготовке проб анализируемых белков для масс-спектрометрии выполнены в соответствии с протоколом, описанным ранее [20]. Масс-спектры (ms) продуктов трипсинолиза получали на масс-спектрометре Ultraflextreme «Bruker» (Германия), оснащенном УФ-лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона в диапазоне масс 700—4500 m/z. Точность измеренных моноизотопных масс после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 50 ррм. При необходимости получали спектры фрагментации ms-ms отдельных пептидов. Для их получения использовали тан-демный режим прибора, точность измерения фрагментных ионов была не ниже 1 Да. Масс-спектры обрабатывали с использованием программного пакета FlexAnalysis 2.4 («Bruker Dalto-nics», Германия).
Идентификацию белков проводили с помощью программы Mascot (опция «пептидный фингерпринт», www.matrixscience.com). Поиск проводили в базе данных NCBI среди белков
всех организмов и/или EST vertebrates. Канди-датные белки, имеющие параметр достоверности score > 83, считали определенными надежно (p < 0,05). С использованием программного обеспечения Biotools 3.0 («Bruker Daltonics», Германия) проводили поиск кандидатных белков по объединенным данным ms + (ms-ms).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Состав низкомолекулярной фракции белков плазмы карповых рыб в электрофорезе. В диск-электрофорезе НМ-фракция плазмы исследованных видов расположена в диапазоне m 0,37—0,87. Традиционно она считается низкомолекулярной, хотя белки в ее составе имеют молекулярные массы выше 40—50 кДа. У всех видов фракция состоит из двух под фракций. В первой выделяется один доминирующий белок; вторая подфракция состоит из нескольких белков, число которых варьировало от 2 до 15-ти (рис. 1, а, б).
Ранее нами было показано, что подфракции различаются по способности связывать альбумин-специфичный краситель синий Эванса: первая подфракция по ходу электрофореза связывала краситель, а вторая не связывала [20, 21]. По этой причине первую подфракцию мы обозначили как альбуминоподобные белки («Alb»), а вторую как неальбуминовые белки («No alb») (рис. 1, в).
В 2D-электрофорезе подфракции организованы сходным образом у всех исследованных видов (рис. 2). Так, в неденатурирующих усло-
виях фракция содержала один доминирующий белок с мол. массой в диапазоне около 100—120 кДа в составе подфракции «Alb» и 2—15 белков с мол. массой от 45 до 100 кДа в составе подфракции «No alb» (рис. 2, a). Однотипной была и структура фракции в денатурирующих условиях (рис. 2, б, в). В Ds-Na-ПААГ в составе фракции у всех видов присутствовали четыре группы белков с мол. массой около 14, 25, 50 и 60 кДа (рис. 2, в). Таким образом, белковый состав НМ-фракции плазмы у различных видов рыб, исследованный с помощью электрофоретических методов, характеризуется значительным схо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.