НЕЙРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 4, с. 287-293
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ РАБОТЫ
УДК 612.015.13-092.41.9:616.8-091.81-079.3
РЕТРАНСЛОКАЦИЯ АКТИВИРОВАННОЙ ПРОТЕИН КИНАЗЫ С-БЕТА II ПРИ КАЛЬЦИЕВОЙ ПЕРЕГРУЗКЕ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
НЕЙРОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК
© 2008 г. Н. А. Персиянцева1, А. П. Большаков2, M. М. Михайлова3, К. Р. Бирих4,
В. Г. Пинелис1*
1ГУ Научный центр здоровья детей РАМН, Москва 2Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва 3Институт общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва 4Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Проводилась одновременная регистрация внутриклеточного уровня Са2+([Са2+];) и внутриклеточной локализации протеин киназы С (ПКС) в культивируемых кортикальных нейронах в режиме реального времени. Для этого нейроны трансфицировали плазмидной конструкцией, кодирующей химерный белок ПКСРП и зеленый флуоресцентный белок (ПКСРП-GFP), и нагружали флуоресцентным кальциевым индикатором fura-2FF. В покое ПКСРП-GFP была равномерно распределена по цитоплазме нейронов коры. При глутаматном воздействии первичный подъем [Ca] сопровождался транслокацией ПКСРП-GFP из цитозоля на плазматическую мембрану. Вторичное повышение [Ca]j совпадало по времени с ретранслокацией ПКСРП-GFP с плазматической мембраны в цито-плазматические органелло-подобные структуры. Схожие органелло-подобные структуры наблюдались при иммунохимическом окрашивании ПКСРП в культивируемых зернистых нейронах мозжечка и коры, подверженных длительному воздействию глутамата. ПКСРП в этих структурах, по-видимому, оставалась активированной, поскольку рецептор активированной С киназы RACK1 в аналогичных условиях также транслоцировался в похожие структуры. Эта кластеризация ПКСРП являлась кальций-зависимой, и могла быть вызвана кальциевым ионофором иономицином. Она не наблюдалась при воздействии кальций-независимым активатором ПКСР форболовым эфиром (РМА), при котором ПКСРП и RACK1 оставались на плазматической мембране. Полученные результаты говорят о том, что потеря нейронами способности поддерживать кальциевый гомеостаз, в частности при гиперстимуляции глутаматных рецепторов, индуцирует специфическое изменение локализации активной ПКСРП.
Ключевые слова: протеин киназа С, глутамат, кальций, отсроченная кальциевая дизрегуляция, рецептор активированной С киназы.
Избыточное высвобождение и накопление в синаптических щелях возбуждающего медиатора глутамата является основной причиной повреждения и отсроченной гибели нейронов после ишемического инсульта, при некоторых нейроде-генеративных заболеваниях и судорожном синдроме. Ключевым звеном в каскаде процессов, инициируемых токсическим воздействием глутамата на нейроны, является внутриклеточная Са2+ перегрузка [1]. До сих пор не известно, активность каких клеточных систем изменяется при нейрональной Са2+-перегрузке и приводит к гибели нейронов. Одним из Са2+-зависимых регуляторов гибели является протеин киназа С [2]. Предполагается, что она участвует в развитии гибели нейронов при эксайтотоксичности, однако сведе-
* Адресат для корреспонденции: 119991, Москва, Ломоносовский пр., 2/62; тел.: 8 (499) 134-14-45; e-mail: vpinelis@nczd.ru
ния о ее роли в этих процессах противоречивы. Показано, что предварительное уменьшение активности и содержания ПКС (down-regulation) в нейронах защищает их от нейротоксичности глутамата [3, 4]. В то же время другие исследователи утверждают, что для защиты клеток от эксайто-токсического повреждения необходимо противодействовать инактивации ПКС [5, 6]. Эти противоречия могут быть результатом того, что в нейронах экспрессируются несколько изоформ ПКС, и инактивация/активация разных изоформ может иметь противоположное влияние на выживаемость нейронов после воздействия глутамата.
Ранее при изучении активности и локализации ПКС в нейронах во время действия глутамата использовался анализ ее активности в различных фракциях клеточного гомогената, а также имму-ноцитохимические методы [3, 5,7-9]. Однако современные методы позволяют регистрировать изменения локализации белков в живых клетках
в реальном времени, например, с использованием трансфекции генетическими конструктами, кодирующими исследуемый белок с присоединенным к нему зеленым флуоресцентным белком (green fluorescent protein, GFP) или его производным [1013]. Этот подход не только позволяет наблюдать изменения в локализации отдельных изоформ ПKC, но и проводить одновременные измерения других внутриклеточных параметров, таких, например, как внутриклеточный уровень Ca2+ ([Ca2+]i). В этой работе мы исследовали зависимость между [Ca2+]i и локализацией Ca^^aBTO^ мой изоформы ПKCßII в культивируемых нейронах, подвергнутых глутаматному воздействию.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проводились на 7-9-дневных первичных культурах зернистых клеток мозжечка и коры головного мозга самцов крыс линии Wistar. Cуcпeнзия клеток готовилась по описанной ранее методике [14]. ^етои ресуспендировались в ней-робазальной среде (NBM "Gibco") с добавлением 2% Supplement B-27 ("Gibco"), 0.5 мM Glutamax ("Gibco"), 100 U/мл пенициллина/стрептомицина ("Gibco") и 20 мM KCl для нейронов мозжечка. Kоличecтво нейронов было 3.5 x 106 клеток/мл. Затем клеточная суспензия (100 мкл) переносилась на стерильные покровные стекла, покрытые поли^-лизином (10 мкг/мл, "Sigma"). Через час неприкрепившиеся клетки удаляли и добавлялось по 1 мл NBM. На 3-4-е сутки культивирования в среду инкубации добавлялось 5 мкM арабинозин-моноцитозида ("Sigma") для подавления пролиферации глиальных клеток. Покровные стекла с клетками в течение 7-9 дней находились в инкубаторе (360 C, 95% воздуха, 5% CO2) в среде NBM.
Для измерения [Ca2+]i клетки нагружались fu-ra-2FF/AM (4 м^, 40 мин, "Mol. Probes"). Покровное стекло с клетками помещалось в разборную перфузионную камеру, смонтированную на предметном столике инвертированного микроскопа Axiovert 200 ("Carl Zeiss"). Нейроны 2-3 раза промывались буфером следующего состава ^M): NaCl 140, KCl 5, MgCl2 2, CaCl2 2, глюкоза 5, HEPES 20, рН 7.4. Все эксперименты проводились при комнатной температуре. Для возбуждения флуоресценции fura-2FF использовался свет длиной волны 340 и 380 нм, флуоресценция пропускалась через фильтр 505-535 нм. Изображение получали с помощью CCD камеры ("Roper Scientific"). Все данные собирались и анализировались компьютерной программой Metafluor 6.1 ("Universal Imaging Corp."). Данные измерений [Ca2+]i представлялись как отношение F340/F380 (где F -интенсивность флуоресценции).
Для изучения внутриклеточных перемещений изоформы ПKCßII культивируемые нейроны коры головного мозга крыс трансфицировали плаз-
мидой, кодирующей ПKCßII-GFP [15], с использованием реагента Lipofectamine 20O0 ("Invitrogen"). Плазмида была любезно предоставлена P. Рицутто (R. Rizutto, Университет Феррары, Италия). GFP был ранее использован для флуоресцентного мечения ПKC и было показано, что он сам по себе не влияет на ее локализацию, транслокацию и активность [16]. Cpeдa культивирования заменялась на новую (1 мл), содержащую 2 мкг cDNA, 6 мкл Lipofectamine 2000 и 100 мкл OptiMEM ("Gibco"). После 5 ч инкубации при 370C среда с Lipofectamine и DNA удалялась и добавлялась свежая. клетки использовали через 24 ч после трансфекции.
Для изучения перемещения ПKCßII и белка RACK1 использовался метод иммунофлуорес-центного окрашивания. Отекла с клетками фиксировались в 4%-ном параформальдегиде (10 мин), затем препараты были пермеабилизованы 0.3% Triton X-100 (15 мин при 40C). После блокирования неспецифического связывания 0.3% BSA (30 мин), препараты инкубировали 1 ч с первичными антителами (Mouse anti-RACKl, "BD Trans-duction Laboratories", Cat. N. 610177; mouse anti-PKCßII, "Sigma", Cat. N. 45H4843). После отмывки (0.3% BSA, 30 мин) препараты в течение часа инкубировали со вторичными антителами (Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse, "Mol. Probes", Cat. N. A21202). Затем стекла промывались буфером и помещали в разборную перфузионную камеру. Mикpоcкоп был оснащен 63x объективом для измерения флуоресценции зонда Alexa FITC. Для возбуждения флуоресценции использовали свет длиной волны 488 нм, для эмиссии 515-565 нм. C помощью CCD камеры получали цифровые изображения экспериментов.
Для определения активности связанной с плазматической мембраной ПKC в лизатах клеток использовали набор PepTag®-анализ ("Promega"). Лизаты нейронов получали в буфере, содержащем 1% Triton X-100. В аликвоты лизатов добавлялась смесь реагентов: буфер, флуоресцентный пептид Cl, содержащий гомологичную последовательность субстратов ПKC, активатор ПKC, ингибиторы протеаз. После 30 мин инкубации при 370C реакция фосфорилирования пептида Cl останавливалась термоинактивацией киназы (10 мин, 980C на водяной бане), затем фосфори-лированный и нефосфорилированный пептиды разгонялись электрофоретически в 0.8% агароз-ном геле (100 V). Изображение геля получали, используя для возбуждения УФ-свет длиной волны 380 нм на приборе DP-001.FDC ("Vilber Lourmat"). Для количественного определения степени фосфорилирования полученные изображения анализировались с помощью программы Scan Array Express ("Perkin Elmer"). Измерения проводились не менее чем в 3 параллельных пробах для каждого данного образца в 3-7 независимых эксперимен-
о w
Рч л
Ö о M я s н
м <
400 300 200 100 0
Контроль Глу Глу 1ч Глу 2ч Глу 3ч Глу 4ч
Рис. 1. Изменение активности мембранной ПКС нейронов мозжечка после 15 мин воздействия глутаматом (Глу) в концентрации 100 мкМ. Глу и Глу 1ч - через 15 мин и через 1 ч после отмывки, Глу 2ч - через 2 ч, Глу 3 ч - через 3ч, Глу 4ч - через 4 ч после отмывки. Приведены данные 3 независимых экспериментов. * р < 0.05 по сравнению с контролем.
тах. Результаты представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение». Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы PRIZM 3.0, для сравнения полученных выборок использовался тест one-way ANOVA. Различия считались достоверными при p < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В первой серии экспериментов мы исследовали активность связанной с плазматической мембраной ПКС после кратков
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.