УДК 572.788:577.151.6
РЕЦЕПТОРНАЯ И ТКАНЕВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДОВ, СООТВЕТСТВУЮЩИХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИМ УЧАСТКАМ РЕЦЕПТОРОВ СЕРПАНТИННОГО ТИПА © 2011 г. А. О. Шпаков1*, Е. А. Шпакова2, И. И. Тарасенко2, К. В. Деркач1
Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН,
пр. М. Тореза, д. 44, Санкт-Петербург, 194223; *факс (812)5523012; электронная почта: alex_shpakov@list.ru 2Учреждение Российской академии наук Институт высокомолекулярных соединений РАН, Большой пр., д. 31, Санкт-Петербург, 199004 Поступила в редакцию 06.06.2011 г.
В большинстве рецепторов серпантинного типа за взаимодействие с гетеротримерными О-белками отвечают проксимальные к мембране участки их третьей цитоплазматической петли (ЦП-3). Пептиды, соответствующие этим участкам, способны в отсутствие гормона активировать О-белки и влиять на передачу гормонального сигнала через гомологичный им рецептор. Однако молекулярные механизмы действия пептидов, их специфичность в отношении рецепторов и тканей-мишеней в настоящее время изучены недостаточно. Цель работы состояла в изучении рецепторной и тканевой специфичности пептидов, соответствующих С-концевым участкам ЦП-3 рецептора лютеинизирующего гормона (ЛГР), ре-лаксинового рецептора 1-го типа (Рел^), соматостатиновых рецепторов 1-го и 2-го типов (Сом^ и Сом2Р) и серотониновых рецепторов подтипа 1В и 6-го типа (Сер1ВР и СербР), на функциональную активность аденилатциклазы (АЦ) и ОррМЫр-связывание О-белков в головном мозге, миокарде и тести-кулах крыс. Обнаружено, что влияние пептидов на АЦ и О-белки отчетливо выражено в тканях, обогащенных гомологичными им рецепторами. Так, стимулирующие АЦ и ОррМЫр-связывание эффекты ЛГР-пептида были наиболее выражены в тестикулах, СербР-пептида — в мозге, Рел^-пептида — во всех изученных тканях, в наибольшей степени в миокарде. Ингибирующие АЦ эффекты Сом^-, Сом2Р- и Сер1ВР-пептидов и стимуляция ими ОррМЫр-связывания были наиболее выражены в мозге. В присутствии пептидов в значительной степени ослаблялось влияние на АЦ гормонов, действие которых реализуется через гомологичные рецепторы, в то время как эффекты других гормонов менялись незначительно. Полученные данные свидетельствуют о том, что биологическая активность пептидов определяется их взаимодействием с комплементарными участками гомологичных рецепторов, что должно учитываться при создании высокоселективных регуляторов гормональных сигнальных систем.
Ключевые слова: аденилатциклаза, пептид, релаксиновый рецептор, рецептор лютеинизирующего гормона, серотониновый рецептор, третья цитоплазматическая петля.
Ключевую роль во взаимодействии рецепторов серпантинного типа, 7 раз пронизывающих плазматическую мембрану, с гетеротримерными О-белками играют проксимальные к мембране участки второй и третьей цитоплазматических петель (ЦП), а также расположенного во внутриклеточном пространстве С-концевого домена рецептора [1]. В большинстве рецепторов эти участ-
Сокращения: АЦ — аденилатциклаза; АЦСС — аденилат-циклазная сигнальная система; ЛГР — рецептор лютеинизирующего гормона; Рел^Р — релаксиновый рецептор 1-го типа; Сер1ВР и Сер^Р — серотониновые рецепторы подтипа 1B и 6-го типа; Сом1Р и Сом2Р — соматостатиновые рецепторы 1-го и 2-го типов; С-ЦП-3 — С-концевой участок третьей цитоплазматической петли; ХГЧ — хорионический гонадотропин человека; ЦП — цитоплазматическая петля; EMD-386088 — 5-хлор-2-метил-3-(1,2,3,6-тетрагидро-4-пи-ридинил)-1Н-индол; Gj и Gs — гетеротримерный G-белок ингибирующего или стимулирующего типов соответственно; PACAP-38 — активирующий аденилатциклазу гипофизарный полипептид (pituitary adenylyl cyclase activating polypeptide).
ки формируют амфипатические а-спирали, являющиеся цитоплазматическим продолжением спиральных трансмембранных доменов, и обогащены положительно заряженными аминокислотными остатками, образующими мотивы ВВХХВ-типа (В — обычно аргинин или лизин). Имеются многочисленные данные о том, что соответствующие этим участкам синтетические пептиды взаимодействуют с О-белками, запускают сопряженные с ними сигнальные каскады и влияют на передачу гормонального сигнала через гомологичные им рецепторы, выполняя функции внутриклеточных антагонистов или агонистов [2—9].
Ранее нами было обнаружено, что пептиды, производные С-концевого участка третьей ЦП (С-ЦП-3) релаксинового рецептора 1-го типа (РелхР) и рецептора лютеинизирующего гормона (ЛГР), сопряженных с О-белками стимулирующего типа (О8-белками), в отсутствие гормона активируют О8-белки, не затрагивая О-белки дру-
гих типов, в частности G-белки ингибирующего типа (Gj-белки), и дозозависимым способом стимулируют активность фермента аденилатциклазы (АЦ) [9—11]. Наиболее активными среди РелхР-пептидов были пептид 615—629 и модифицированный пальмитатом пептид 619—629, среди ЛГР-пептидов — пептид 558—572 и пальмитоилирован-ный пептид 562—572. Изучение линейных, ди-мерных и модифицированных гидрофобными радикалами пептидов, производных С-ЦП-3 серо-тониновых рецепторов подтипа 1B и 6-го типа (Сер1вР и Сер6Р), которые сопряжены, соответственно, с G¡- и Gg-белками, показало, что они селективно активируют G-белки, сопряженные с гомологичным рецептором, и регулируют активность аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС) в головном мозге крыс [8, 12, 13]. Наиболее эффективными среди них были Сер1вР-пеп-тид 306—316 и пальмитоилированный Сер6Р-пеп-тид 258—268. С помощью селективных агонистов и антагонистов СерР показано, что действие пептидов реализуется в основном в отношении гомологичных им типов СерР. Изучение пептидов, соответствующих С-ЦП-3 соматостатиновых рецепторов 1-го и 2-го типов (Сом1Р и Сом2Р), сопряженных с АЦ посредством Gj-белков, показало, что Сом1Р-пептид снижает регуляторные эффекты соматостатина и агониста Сом1Р — CH-275, и служит внутриклеточным антагонистом Сом1Р, в то время как Сом2Р усиливает способность CH-275 ингибировать АЦ, но слабо влияет на эффекты Сом2Р-агониста октреотида, являясь, таким образом, агонистом Сом1Р [14].
В последние годы появились данные о том, что пептиды, производные ЦП рецепторов, регулируют физиологические и биохимические процессы в условиях in vivo, что указывает на возможность создания на их основе регуляторов эндокринной и других систем организма [3, 5, 6, 15— 17]. Однако молекулярные механизмы действия пептидов на гормональные сигнальные системы и на клетку в целом исследованы недостаточно, что в значительной степени тормозит их применение в фундаментальной биологии и практической медицине. В частности, мало изучен вопрос о рецептор-ной и тканевой специфичности пептидов, производных ЦП рецепторов серпантинного типа.
Цель работы состояла в изучении рецепторной и тканевой специфичности синтезированных нами ранее пептидов, производных С-ЦП-3 рецепторов серпантинного типа, на функциональную активность АЦСС. Мы выбрали пептиды, производные С-ЦП-3 ЛГР, Рел1Р и Сер6Р, сопряженных с Gg-белками, и Сер1вР, Сом1Р и Сом2Р, сопряженных с Gj-белками, которые обладали наиболее выраженной биологической активностью и селективностью действия в отношении белков-компонентов АЦСС. Для изучения рецепторной специфичности действия пептидов анализировали их влияние на регуляцию АЦСС гормонами различной природы. Для изучения тканевой спе-
цифичности были выбраны головной мозг, миокард и тестикулы — мишени гормонов, действие которых на клетку осуществляется через рецепторы, гомологичные исследуемым пептидам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали серотонин, соматостатин, хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), активирующий АЦ гипофизарный полипептид длиной 38 аминокислотных остатков (PACAP-38), изо-протеренол (Sigma, США), Сом^-агонист CH-275 (Neosystem, Франция), Сом2Р-агонист октреотид (Novartis Pharma, Швейцария), Сер6Р-агонист 5-хлор-2-метил-3-(1,2,3,6-тетрагидро-4-пиридинил)-1Н-индол (EMD-386088), Сер1вР-агонист 5-нони-локситриптамин (Tocris Cookson Ltd., Великобритания). Колоночную хроматографию проводили на нейтральной окиси алюминия (Sigma, США), связывание GTP определяли с использованием нитро-целлюлозных фильтров типа HA, 0.45 мкм (Milli-pore, США). Активность АЦ определяли с использованием [a-32P]ATP (1000 Ки/ммоль) (ОАО Институт реакторных материалов, Россия), определение связывания GTP проводили с р,у-имидо[8-3Н]-гуано-зин-5'-трифосфатом ([8-3H]GppNHp) (5 Ки/ммоль) (Amersham, Англия).
Пептиды, соответствующие С-ЦП-3 рецепторов (табл. 1), были синтезированы стандартным твердофазным методом с помощью полуавтоматического синтезатора NPS-4000 (Neosystem Laboratoires, Франция), как описано ранее [8—10, 13, 14]. Для защиты функциональных групп аминокислот использовали трет-бутилоксикарбонильную, бен-зильную, мезитиленсульфонильную, 2-хлорбензи-локсикарбонильную группы. s-Пальмитоилиро-ванный лизин, который использовали для синтеза модифицированных пальмитатом ЛГР- и Сер6Р-пептидов, получали конденсацией пентафторфе-нилового эфира пальмитиновой кислоты и Na-трет-бутилоксикарбониллизина с помощью дии-зопропилкарбодиимида в присутствии триэтил-амина. Предварительную очистку пептидов проводили методом гель-хроматографии на BioGel P-2 в 6% уксусной кислоте, а дальнейшую — с помощью ВЭЖХ на колонке Vydac C18 в системе вода—ацето -нитрил—0.1% трифторуксусная кислота при использовании линейного возрастающего градиента ацетонитрила. Выделенные фракции имели 95% чистоты, считая от базовой линии (УФ-де-текцию проводили при 230 нм). Структуру пептидов подтверждали данными аминокислотного и масс-спектрометрического анализа.
Исследования проводили на самцах крыс линии Wistar (n = 27, масса тела 310 ± 35 г). Фракции синаптосомных мембран из мозга крыс выделяли согласно [18] с некоторыми модификациями [8]. Кору больших полушарий, стриатум и гиппокамп гомогенизировали при помощи Политрона в охлажденном до 4°C 50 мМ трис^О-буфере (pH 7.4), содержащем 10 мМ MgCl2, 2 мМ EGTA,
Таблица 1. Структура пептидов, производных С-концевых участков третьей цитоплазматической петли рецепторов серпантинного типа
Рецептор Первичная структура M -^рассч. M -^эксп.
ЛГР N
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.