Объединенный иммунологический форум, Нижний Новгород 2013
РЕЦЕПТОРЫ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ, ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА ВНУТРИ КЛЕТОК, ГЛАВНЫЙ КОМПЛЕКС ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ
Анализ двух полиморфизмов гена TLR 4 у больных туберкулезом легких представителей русской популяции Челябинской области
Беляева С. В.1, Бурмистрова А.Л.1, Суслова Т. А.2, Ананьева И. П.3
1Челябинский государственый университет,2 ОГУП «ЧОСПК»,3 ГУЗ «Противотуберкулезный диспансер № 3», Челябинск, Россия
Toll-подобные рецепторы (TLRs) являются ключевыми участниками врожденного иммунитета против микобактерий. Гены TLR 4 локализованы на 9 хромосоме (9q33.1). Наиболее изучены два SNP полиморфизма гена TLR4: Asp299Gly (A/G) и Thr399Ile (C/T). Данные положения приводят к изменениям в лиганд-связывающем сайте рецептора. Аллель Asp299Gly сопровождается провос-палительным фенотипом, тогда как Asp299Gly/Thr399Ile гаплотип не имеет функциональных отличий от дикого типа TLR4. Обнаружена ассоциация активного туберкулеза с полиморфизмом Asp299Gly (Pulido et. al. 2010, Newport et al. 2004, Rosas-Taraco et al. 2007).
Цель исследования: провести сравнительный анализ распределения аллелей, гаплотипов и генотипов гена TLR 4 (в позициях 299 и 399) у здоровых лиц и больных туберкулезом легких русских Челябинской области. Материалы и методы. Исследуемую группу составили 86 больных туберкулезом легких русской национальности, находящихся на стационарном лечении в ГУЗ «Противотуберкулезный диспансер № 3» г. Челябинска. Больные представлены в трех группах с разными фенотипами заболевания: 1 - ограниченные процессы, 2 - распространенный туберкулезный процесс, 3 - хронические формы туберкулеза. Группу сравнения составили 85 практически здоровых лиц русской популяции. Группы имели одинаковый социоэкономический статус. Типирование SNPs в гене TLR 4 проводилось методом ПЦР-SSP с эндонуклеа-зами рестрикции Ncol (299A/G) и Hinf (399 C/T). Для статистической обработки использовались стандартные генетические методы: расчет непараметрического критерия х2 с поправкой Йетса. Расчет частот гаплотипов проводился методом максимального правдоподобия с помощью компьютерной программы Arlequin 3.1 (http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3/). Результаты. Достоверные различия в распределении аллелей, генотипов и гаплотипов TLR 4 (299 и 399) между больными туберкулезом и контролем и между группами больных не были обнаружены. Гетерозиготные генотипы полиморфизма 299TLR4 A/G у больных встречались только в составе гетерозиготного гаплотипа с генотипом 399TLR4 C/T (299TLR4 A/G/399TLR4 C/T). В контрольной группе данная зависимость не была обнаружена. На уровне тенденции у больных с малыми формами заболевания (1 группа) повышена частота встречаемости гетерозиготного генотипа A/G, а также двойного гетерозиготного гаплотипа по сравнению с больными с более тяжелыми формами заболевания (2 и 3 группы).
Выводы. Достоверные различия в распределении аллелей, генотипов и гапло-типов TLR 4 (299 и 399) между больными туберкулезом и группой контроля и среди групп больных туберкулезом легких русских Челябинской области не были обнаружены.
Взаимосвязь аллельного полиморфизма генов рецепторов ФНО-альфа I и II типов с уровнем экспрессии мембраносвязанных рецепторов и сывороточным уровнем растворимых рецепторов Васильев Ф. Ф., Лопатникова Ю. А., Силков А. Н. Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск, Россия
Актуальность. Проявление биологических эффектов многофункционального плейотропного цитокина ФНОа зависит от уровня экспрессии рецепторов на клетках. Различие в уровне экспрессии рецепторов ФНОа может быть обусловлено полиморфизмом генов.
Цель исследования. Установление взаимосвязи полиморфизмов генов рецепторов ФНОа с уровнем экспрессии мембраносвязанных рецепторов ФНОа I и II типов на различных субпопуляциях мононуклеарных клеток, а также с уровнем растворимых рецепторов ФНОа I и II типов в сыворотке крови 150 условно здоровых доноров.
Материалы и методы. Определение уровня экспрессии мембраносвязан-ных рецепторов ФНОа на субпопуляциях мононуклеарных клеток проводилось методом проточной цитометрии с использованием калибровочных частиц ОиапШШЕ РЕ. Определение сывороточного уровня растворимых рецепторов ФНОа проводилось методом ИФА. Генотипирование проводилось методом ПЦР-ПДРФ.
Результаты. Гомозиготные индивиды с генотипом ТТ в точке -609 С/Т промотора гена ТМИ (^4149570) характеризовались сниженным уровнем растворимых рецепторов ФНОа I типа, в сравнении с носителями генотипа СС (р=0,006). Носители генотипа СС в точке -1207 С/С промотора гена ТЮТ! (гб41 49569), имели меньшую плотность экспрессии мембраносвязанных рецепторов ФНОа I типа на CD14+ моноцитах, по сравнению с носителями генотипа СС (р=0,012). У здоровых индивидов, несущих генотип АА по сравнению с индивидами с генотипом АТ, установлено частотное различие по процентному содержанию CD3+ (р=0,024) и CD19+ (р=0,032) клеток, экспрессирующих рецепторы ФНОа II типа в точке -1709 А/Т гена ТШИ (^652625). Носители генотипа СС в позиции -3609 С/Т гена ТШН (^590368) имели пониженное процентное содержание CD14+ клеток, экспрессирующих рецепторы ФНОа II типа, по сравнению с носителями генотипа СТ (р=0,015).
Заключение. Таким образом, нами установлена взаимосвязь полиморфизмов генов рецепторов ФНОа I и II типов с уровнем экспрессии мембранос-вязанных рецепторов на субпопуляциях мононуклеарных клеток и уровнем растворимых рецепторов ФНОа I типа в сыворотке крови условно здоровых доноров. Показано, что аллельный полиморфизм генов рецепторов ФНОа является одним из механизмов, определяющих вариабельность экспрессии мембраносвязанных рецепторов и, соответственно, обеспечивающий различия в степени проявления биологических эффектов иммуномодулирующего медиатора ФНОа.
Влияние активации TLR-4 липополисахаридами различной структуры на экспрессию рецептора CD11b
Зубова С. В.1, Прохоренко И. Р.1, Косякова Н. И.2 ' Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 2 Больница Научного Центра РАН, Пущино Московской обл., Россия
Толл-подобный рецептор 4 является сигнальным рецептором для липопо-лисахаридов (ЛПС). Ответы клеток по интенсивности и по набору цитокинов зависят от структуры ЛПС. R- и S-формы ЛПС сигнализируют через TLR4, но различаются по потребности участия CD14 для сигнализации. R-форма ЛПС взаимодействует с TLR4 независимо от CD14. ЛПС, активирующие ответы клеток, влияют на экспрессию рецепторов, участвующих в запуске ответных реакций. В циркулирующих нейтрофилах интегрины (CD11b/CD18) находятся в неактивном состоянии, но активируются после стимуляции Толл-подобных рецепторов (Means and Luster, 2010).
Целью работы было изучение влияния структуры липида А, состава кора и полисахаридного фрагмента ЛПС из токсичных энтеробактерий E. coli и Salmonella enterica на экспрессию рецептора CD11b на нейтрофилах цельной крови условно здоровых доноров.
Цельную гепаринизированную кровь стимулировали в течение 6 ч с помощью различных ЛПС в конечной концентрации 100 нг/мл (E. coli S-, Ra-, Rc-, Rd-, Re-структуры, S. enterica serotype Typhimurium S-, Re-структуры, и S. enterica serotype Minnesota R7 Rd-структуры). После стимуляции образцы цельной крови инкубировали с моноклональными антителами к CD11 b (BioLegend) в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Эритроциты лизи-ровали с помощью лизисного буфера (BioLegend), лейкоциты отделяли центрифугированием при 300 g 5 мин. Клетки промывали с помощью буфера для окрашивания (BioLegend), осадок лейкоцитов ресуспендировали в 400 мкл данного буфера. В качестве негативного контроля использовали мышиный IgG1 (BioLegend). Экспрессию рецепторов популяции нейтрофилов анализировали на проточном цитофлуориметре EPICS XL-MCL (Beckman Coulter). В ответ на активацию эндотоксинами (ЛПС) гранулоциты дополнительно экспрес-сируют на своей поверхности адгезивные Р2-интегрины - молекулы CD11b/CD18 (Verbon 2001, 10 Power 2001) и усиливают высвобождение цитокинов (Wright 1995). После инкубации крови с разными ЛПС из E. coli или из Salmonella в течение 6-ти часов наблюдалась дополнительная экспрессия CD11b рецептора на поверхности нейтрофилов. Максимальная экспрессия CD11 b наблюдалась на нейтрофилах, активированных Re-хемотипом ЛПС, в состав которого входят только липид А и КДО. По мере удлинения внутреннего кора от Re- к Ra- и далее к полной S-структуре эффект активации снижался. На основании полученных результатов, можно сделать вывод, что основной вклад в активацию клеток, приводящую к дополнительной экспрессии инте-грина CD11b, вносит липид А. При этом существенную роль играет собственно структура самого липида А. Липид А из E. coli, в состав которого входит 6 жирных кислот, проявляет значительно более высокую активность, чем липид А из Salmonella, в состав которого входит 5 или 7 жирных кислот.
Уровни экспрессии мембранных рецепторов фактора некроза опухоли альфа у больных туберкулезом легких и здоровых индивидов
Киреев Ф.Д.1, Альшевская А.А.1, Лаушкина Ж. А.2
1 НИИ клинической иммунологии СО РАМН, 2 Новосибирский НИИ туберкулеза Минздрава России, Новосибирск, Россия
Актуальность. Фактор некроза опухоли альфа (TNF) играет важную роль в иммунном ответе против микобактерии туберкулеза. Биологические эффекты этого цитокина опосредуются посредством взаимодействия с мембранными рецепторами первого и второго типов (TNFR1 и TNFR2). Целью работы явилось изучение уровня экспрессии рецепторов TNF 1 и 2 типов с оценкой абсолютного числа данных рецепторов на различных субпопуляциях иммунокомпетентных клетках.
Материалы и методы. В работе использована периферическая кровь 25 больных активным туберкулезом легких и 150 здоровых доноров. Мононуклеарные клетки получали из цельной крови методом центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколл-урографин. Процент Т-, В-клеток и моноцитов, экс-прессирующих TNFR1 и TNFR2, определяли методом проточной цитометрии с использованием фикоэритрин (РЕ)-меченных антител. Число рецепторов на клетках определяли, используя калибровочные бусы QuantiBRITE PE calibration b
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.