МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 3, с. 320-327
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.22+577.15+579.887
РИБОНУКЛЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКОПЛАЗМ
© 2014 г. О. Н. Ильинская*, 1, Ю. В. Сокуренко*, В. В. Ульянова*, В. И. Вершинина*, П. В. Зеленихин*, А. И. Колпаков*, Е. С. Медведева**, Н. Б. Баранова**, М. Н. Давыдова**, А. А. Музыкантов**, О. А. Чернова**, В. М. Чернов**
*Казанский (Приволжский) федеральный университет **Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦРАН Поступила в редакцию 19.08.2013 г.
Не обладая способностью к синтезу нуклеотидов de novo, микоплазмы должны секретировать нук-леодеполимеразы для пополнения пула предшественников нуклеиновых кислот. Нуклеазная активность микоплазм является важным фактором их патогенности. У бактериальных рибонуклеаз (РНКаз) обнаружен широкий спектр биологической активности, включая проивовирусную и противоопухолевую, что вызывает значительный интерес и к РНКазам микоплазменного происхождения. В работе охарактеризована способность микоплазм Acholeplasma laidlawii и Mycoplasma hominis к синтезу и секреции РНКаз. Установлено, что эти микроорганизмы в стационарной фазе роста синтезируют М£2+-зависимые РНКазы, максимальная активность которых зафиксирована вне клеток. Впервые определена локализация РНКаз A. laidlawii: практически 90% РНКазной активности данного микроорганизма ассоциировано с мембранными везикулами. Методами биоинформационного анализа установлена гомология нуклеотидных последовательностей 14 генов Bacillus subtilis, продукты которых обладают РНКазной активностью, с генами исследуемых микоплазм, также выявлено сходство аминокислотных последовательностей 4-х рибонуклеолитических белков A. laidlawii с РНКазой Bsn.
Ключевые слова: микоплазмы, Acholeplasma laidlawi, Mycoplasma hominis, рибонуклеазная активность, локализация, везикулы.
DOI: 10.7868/S0026365614030070
Интерес к микоплазмам (класс Mollicutes) обусловливается уникальностью биологии мельчайших прокариот и целым рядом практических задач. Большинство микоплазм — паразиты человека, животных и растений, некоторые — возбудители социально-значимых заболеваний, контаминанты клеточных культур и вакцинных препаратов [1]. Контроль микоплазменных инфекций и контаминаций представляет проблему, решение которой связывают с исследованиями основ адаптации микоплазм к условиям среды, определяющим их широкую распространенность в природе и проявление патогенности. Успешная реализация геномных проектов в отношении ряда микоплазм определила возможность использования постгеномных технологий для проведения соответствующих исследований. Уникальными по адаптивности видами микоплазм являются известные контаминанты клеточных культур Acholeplasma laidlawii (возбудитель фитомикоплаз-мозов) и Mycoplasma hominis (возбудитель респи-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: ilinskaya_kfu@mail.ru).
раторных и урогенитальных заболеваний человека) [2, 3]. В результате транскриптомно-протеомного анализа и наноскопии были идентифицированы стресс-реактивные белки этих микроорганизмов [4, 5] и показано, что адаптация и вирулентность микоплазм в значительной мере связаны с секрецией эстраклеточных мембранных везикул [6, 7].
Важным фактором патогенности микоплазм является нуклеазная активность. В отличие от других эубактерий, микоплазмы не способны к синтезу предшественников нуклеиновых кислот de novo. Наличие нуклеазной активности определяет возможность получения необходимых клеткам микоплазм предшественников для синтеза нуклеиновых кислот [2, 3]. Рибонуклеолитиче-ская (РНКазная) активность может в значительной мере обусловливать генотоксические свойства этих бактерий [8]. Ранее было показано, что нуклеазная активность микоплазм в основном связана с мембраной [9]. Между тем данные про-теомного профилирования свидетельствуют, что эстраклеточные мембранные везикулы ряда бак-
терий опосредуют трафик РНКаз [10, 11]. В связи с этим анализ везикул микоплазм на наличие РН Казной активности представляет особый интерес.
Малые размеры генома микоплазм ассоциированы с его высокой информационной емкостью [12, 13]. Несмотря на особенности структуры генов микоплазм, установлена значимая гомология нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующих белки, в частности, РНКаз, участвующих в метаболизме этих микроорганизмов и филогенетически близких им бактерий — бацилл [14, 15]. Так, ген rnhC, один из трех генов B. subtilis, кодирующих внутриклеточные неспецифические эндо-рибонуклеазы, расщепляющие 3'-O-P связь РНК в дуплексе ДНК/РНК, кодирует РНКазу HIII (33.9 kDa), и имеет гомологию с генами M. genitali-um (GenBank, accession no. MG199) и M. pneumoniae (GenBank, accession no. C09_orf143b) [16]. Что касается внеклеточных РНКаз, то секретиру-емую РНКазу Bsn (241 амиинокислот, 27кДа) в B. subtilis кодирует ген bsn [17], гомологичный фермент (биназа-II, 292 аминокислоты, кодирующий ген birB) также продуцирует B. pumilus [18]. Эти факты обусловливают целесообразность поиска в геномах микоплазм генов секретируемых РНКаз, гомологичных бациллярным.
РНКазы применяются в генной инженерии, молекулярной биологии и биотехнологии для удаления РНК из биологического материала, структурно-функциональных исследований нуклеиновых кислот и их комплексов с белками, разработке векторов для позитивной селекции рекомбинантов, получения стерильных трансгенных растений. Перспективный прикладной аспект использования микробных РНКаз связан с их антивирусным и противоопухолевым потенциалом [19, 20]. Изучение РНКаз микоплазм поможет расширить понимание о природе патогенности этих бактерий и выявить новые аспекты значимости РНКаз для физиологических процессов.
В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явились поиск и характеристика РНКазной активности Acholeplasma laidlawii и Mycoplasma hominis, выявление оптимальных параметров ее проявления и установление основной локализации в клетке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы. В качестве объектов исследования были использованы штаммы бактерий Acholeplasma laidlawii PG8 и Mycoplasma hominis PG37, полученные из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи.
Культивирование. A. laidlawii PG8 и M. hominis PG31 культивировали на среде Эдварда с незначительными модификациями [21] при 37°С. Кон-
троль роста культур осуществляли визуально по изменению окраски фенолового красного в среде, параллельно определяли количество колоние-образующих единиц в 1 мл среды (КОЕ/мл). Продолжительность культивирования для измерения РНКазной активности клеток и выделения мембранной фракции составляла 30 ч (стационарная фаза роста, 1.2 х 109 КОЕ/мл).
Изоляция мембран клеток. Клетки осаждали с помощью центрифугирования (10000 g, 10 мин), дважды отмывали в буфере (0.05 М трис-НС\, рН 7.4, 0.15 М ШС1, 0.01 М 2-меркаптоэтанол) и лизировали в деионизованной воде (37°С 30 мин). Не лизировавшиеся клетки осаждали помощью центрифугирования (10000 g, 10 мин), а супернатант центрифугировали при 37 000 g в течение 40 мин, чтобы осадить мембранную фракцию. Мембраны дважды отмывали тем же буфером без 2-меркаптоэтанола, ресуспендировали в 1000 мкл буфера и хранили при —20°С.
Выделение мембранных везикул A. laidlawii PG8. Мембранные везикулы выделяли из 200 мл культуры как описано ранее [6]. Клетки осаждали с помощью центрифугирования (15000 g, 40 мин), а супернатант концентрировали с помощью концентратора Vivacell 100 ("Sartorius Stedim Biotech GmbH", Германия). Концентрат фильтровали через стерильный ацетат-целлюлозный фильтр ("Sartorius Minisart", Франция) с размером пор 100 нм. Далее фильтрат концентрировали с помощью концентратора Amicon Ultra-15 100K ("Milli-pore", США) и шестикратно промывали буфером (50 мМ трис-HCl, pH 7.4; 150 мМ NaCl). Суспензию хранили при 8°С.
Получение периферийных белков. Для получения различных фракций периферийных белков клетки A. laidlawii PG8 и M. hominis PG37 последовательно ресуспендировали в десятикратных объемах растворов различной ионной силы и центрифугировали 20 мин при 4400 g (4°C). Использовали три раствора: № 1 (50 мМ трис-HCl, 0.15 M NaCl и 2 мМ MgCl2), № 2 (50 мМ трис-HCl, 0.075 M NaCl и 1 мМ MgCl2) и № 3 (50 мМ трис-HCl, 0.0375 M NaCl и 0.5 мМ MgCl2), при этом ресуспендирование в растворе № 1 проводили два раза. Таким образом, были получены четыре фракции периферийных белков: Ia, Ib, II и III, для обеих микоплазм.
Определение активности РНКаз. Количественное определение рибонуклеазной активности проводили модифицированным методом Анфин-сена по кислоторастворимым продуктам гидролиза РНК [22]. Активность РНКаз определяли в супернатанте культуральной жидкости, чистой среде, мембранной фракции, 4-х фракциях периферийных белков, фракции цитоплазматических белков после лизиса (только для A. laidlawii PG8), фракции мембранных везикул (только для A. laid-
Таблица 1. Гомологичные гены B. subtilis, A. laidlawii и M. hominis, продукты которых обладают РНКазной активностью
Название кодируемого белка* Локус гена в геноме
B. subtilis A. laidlawii M. hominis
Рибонуклеаза III BSU15930 ACL_0228 MH0_4690
Рибонуклеаза J1 BSU14530 ACL_0309 MH0_3380
Рибонуклеаза HII BSU16060 ACL_0338 MH0_3300
АТФ-зависимая РНК хеликаза BSU04580 ACL_0432 -
АТФ-зависимая РНК хеликаза BSU04580 ACL_0481 -
Рибонуклеаза J1 BSU14530 ACL_0832 MH0_3690
Полинуклеотидфосфорилаза (PNPase) BSU16690 ACL_0808 -
Рибонуклеаза M5 BSU00410 ACL_0015 MH0_2160
Рибонуклеаза III BSU15930 ACL_0637 MH0_0830
Рибонуклеаза P BSU41050 ACL_1432 MH0_0020
Рибонуклеаза для созревания 23S РНК BSU00950 ACL_0144 -
Гипотетическая экзорибонуклеаза BSU31470 ACL_0307 -
Рибонуклеаза R BSU33610 ACL_0405 MH0_1900
Рибонуклеаза HIII BSU28620 ACL_0815 MH0_3300
* Названия даны по аннотации генома B. subtilis и могут отличаться у микоплазм.
lawii PG8). Белок определяли по Брэдфорду [23]. За единицу активности принимали количество фермента, вызывающее увеличение оптической плотности в опытных пробах по сравнению с контрольными на 1 единицу за 1 ч инкубации, в пересчете на 1 мл ферментного раствора. Удельную активность рассчитывали на 1 мг белка.
Биоинфо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.