ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 3, с. 336-345
^ ОБЩАЯ
ГЕНЕТИКА
УДК 575.1:595.773.4
РОДСТВЕННЫЕ ОТНОШЕНИЯ ДРОЗОФИЛ ГРУППЫ virilis, РЕКОНСТРУИРОВАННЫЕ НА ОСНОВЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНА Rasl
© 2008 г. А. И. Чекунова1, А. М. Куликов1, С. С. Михайловский1, О. Е. Лазебный1, И. В. Лазебная2, В. Г. Митрофанов1
1 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук, Москва 119334;
e-mail: amkulikov1962@mail.ru 2 Институт общей генетики им. Н И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991
Поступила в редакцию 17.08.2006 г.
Окончательный вариант получен 02.04.2007 г.
Проведен сравнительный анализ группы близкородственных видов Drosophila (D. virilis, D. lummei, D. novamexicana, D. americana texana, D. flavomontana, D. montana, D. borealis, D. lacicola, D. littoralis, D. kanekoi, D. ezoana) по неполной последовательности гена Rasl. Полученная картина взаимоотношения видов соответствует той, которая предполагалась ранее на основании анализа морфологических и цитогенетических признаков. Приведены статистические данные в пользу нейтральности рассматриваемых замен в гене Rasl. Такой характер эволюции гена Rasl придает большую надежность реконструкции филогенетических отношений близких видов. Итоговое дерево для основных филад выглядит следующим образом: (D. virilis (D. lummei, D. montana, D. ezoana)).
До сих пор представления о филогенетических связях между близкородственными видами, полученные по данным анализа белковых и нуклео-тидных последовательностей, вступают в явное противоречие с построениями на основе анализа морфологических признаков [1]. Характерный пример, иллюстрирующий эту проблему, - оценка родственных отношений в группе близнецовых видов Drosophila virilis, неоднократно проводившаяся по молекулярным, цитогенетическим и морфологическим данным [2-7]. Интерес к этой группе видов как к модели видообразования вызван тем, что виды, близкие к D. virilis, обладают широким спектром изолирующих механизмов, предоставляющих возможность выявления закономерностей различных этапов видообразования. Первые работы, посвященные оценкам степени родства видов-близнецов группы D. virilis, принадлежат Паттерсону и Стоуну [8]. С тех пор представление о структуре эволюционных взаимосвязей стало принципиальным для всех исследований, проводимых на этой группе. Согласно некоторым молекулярным данным, вид D. virilis обладает наивысшим родством с видами D. lummei, D. americana и D. novamexicana, что явилось основанием для выделения этих видов в филаду D. virilis [2-4, 9, 10]. Однако другие молекулярные данные противоречат этой точке зрения. Например, вид D. virilis имеет две формы гена 5S рРНк [11], тогда как виды филад lummei и montana содержат в своих геномах только один из этих вариантов, специфичный для своей филады. Этот
факт - весомый аргумент в пользу более позднего разделения филад lummei и montana относительно отделения D. virilis от общего предка. Нурминский с соавт. [12] нашел в геномах D. montana, D. lacicola и D. virilis сходные дупликации в локусе гена Adh. Авторы рассмотрели их как независимо возникшие дупликации, поскольку эти виды принадлежат разным филадам. Однако они могут иметь и общее происхождение. Тогда эти данные можно трактовать как свидетельство прямого родства видов филады montana и вида D. virilis.
Можно ожидать, что наиболее точную оценку родственных отношений между таксонами способен обеспечить анализ последовательностей ДНК, находящихся под действием строгого стабилизирующего отбора, следовательно, в соответствии с теорией нейтральности Кимуры, накапливающих изменчивость, близкую к нейтральной. Хорошим кандидатом на роль такой последовательности является ген Rasl. Его продукт играет важную роль в передаче сигналов в составе Ras-зависимых сигнальных каскадов. Значительная генетическая изменчивость в Ras-сигнальных путях, обнаруженная у разных видов дрозофил, не связана с функциональной активностью Ras-белков, которая остается неизменной у всех изученных видов [13].
В связи с важной ролью продукта гена Rasl в сигнальной трансдукции, следствием которой является крайняя степень консерватизма последовательности этого гена, встает вопрос о характе-
Таблица 1. ^псок линий, используемых в эксперименте
Вид Украшение Линия Место сбора (год)
D. virilis Vi 2* Краснодар, Россия(1965)
D. lummei Lu 200* Серебряный бор, Москва, Россия (1965)
D. novamexicana No 424* Texas Univ., Prof. Stone (1965)
D. americana tex. Te 1041.22* Новый Орлеан, Луизиана, США
D. borealis Bo 540* Texas Univ., Prof. Stone (1965)
D. ezoana Ez 572* Кедровая падь, Приморский край, Россия (1987)
D. flavomontana Fl 0981.3** Гамильтон, Колорадо, США (1949)
D. montana Mo 1021.22** Анкоридж, Аляска, США (1960)
D. kanekoi Ka 1540* Хоккайдо, Япония (1981)
D. lacicola La 0991.13** Манитоба, Канада (1949)
D. littoralis Li 1001.3** Газвин, Иран (1967)
D. melanogaster Mel Oregon R* -
* Коллекция лаб. генетики ИБР РАН. ** Коллекция National Drosophila Species Resource Center, Bowling Green USA.
ре полиморфизма Еая1 при видообразовании. Для решения этой задачи была использована группа видов-близнецов О. утН8. В нашей работе проведено исследование изменчивости последовательности 2-го интрона и участков 1-го и 2-го экзонов гена Rasl у дрозофил группы утНз (подрод Огозо-ркПа).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Линии дрозофил и условия их содержания. Использовали 11 линий дрозофил группы virilis 11 видов дикого типа из коллекций ИБР РАН и National Drosophila Species Resource Center, Bowling Green, USA: D. americana texana Stone, Griffen, Patterson; D. borealis Patterson; D. ezoana Takada, Okada; D. flavomontana Patterson; D. kanekoi Watabe, Higuchi; D. lacicola Patterson; D. littoralis Meigen; D. lummei Hackman; D. montana Patterson, Stone, Griffen; D. novamexicana Patterson и D. virilis Sturte-vant. Происхождение линий и принятые сокращения указаны в табл. 1. В качестве внешнего вида была использована D. melanogaster. Каждый вид был проанализирован в трех повторностях.
При описании результатов пользовались таксономической классификацией группы virilis, подразделяющей ее на три основные филады: virilis, представленную единственным видом D. virilis; montana и lummei, включающие виды классической филады virilis за исключением собственно D. virilis [4].
Все культуры дрозофил велись при температуре 25°С на стандартной манно-дрожжевой кормовой среде, в пробирках диаметром 23 мм и с объемом корма 5-7 мл.
Экстракция и амплификация ДНК. В работе использованы соли и буферы производства фирмы "Sigma" (США), реактивы для электрофореза и стандарты размера ДНК фирмы "Life Technologies" (Великобритания), а также набор для поли-меразной цепной реакции "Амплификация ДНК" фирмы НП АО "СИЛЕКС М", Россия.
ДНК экстрагировали из гомогената самцов, по стандартной методике [14]. Для ПЦР-реакции использовали 1-2 мкл смеси ДНК.
Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 30 мкл, содержащем 10 мМ трис-HCl (pH 8.0), 50 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 10 мг BSA, по 0.2 мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP), 20 пМ праймера, 50 нг ДНК-матрицы, 1 единицу Гад-полимеразы ("Хеликон", Россия). Испарение с поверхности реакционной смеси предотвращалось добавлением 25 мкл вазелинового масла [15]. Для проведения полимеразной цепной реакции использовался термоциклер PCH-3 ("Techne", Великобритания) по следующей программе: 94°С - 2 мин (инициирующая денатурация), 94°С - 15 с (денатурация), 55°С - 20 с (отжиг праймеров), 72°С - 30 с (построение цепи ДНК); всего 35 циклов. Продукты амплификации после 35 циклов анализировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в 1х TBE-буфере и фотографировали в УФ-свете. Для получения ампликонов использовались прай-меры: TACGATCCCACCATCGAGGA - прямой и TTGTTGCCCACGAGCACCAT - обратный. Очистку продуктов ПЦР проводили "набором для выделения ДНК из агарозного геля" фирмы "Хеликон" (Россия).
Нуклеотидная последовательность продуктов ПЦР была определена методом циклического се-
квенирования с использованием набора ABI PRISM и автоматического ДНК-секвенатора 375А фирмы "Applied Biosystems", США. Секвенирование проводили дважды с использованием прямого и обратного праймеров. Полученные последовательности размещены в банке данных под номерами EF212396-EF212406.
Последовательность исследуемого фрагмента была использована для оценки филогенетического родства видов группы D. virilis.
Статистическая обработка результатов. Филогенетический и молекулярный анализы были проведены с использованием программы MEGA version 3.0 [16]. Выравнивание последовательностей проводили методом ClustalW c одинаковыми параметрами для попарных и множественных сравнений: штраф за появление разрыва - 5, штраф за величину разрыва - 2, и с весом транзи-ций, равным 0.7. Для оценки числа ожидаемых и оцененных синонимичных и несинонимичных замен, а также в тестах на отбор мы использовали модифицированную модель подстановки Нея-Годжобори (Modified Nei-Gojobori). При филогенетических построениях использовали метод Neighbor-Joining и в качестве модели подстановки -трехпараметрическую модель Тамуры, применяя в одном случае полное удаление всех сайтов с недостающими/пропущенными нуклеотидами, полученными в ходе выравнивания последовательностей, в другом случае - попарное удаление пропущенных сайтов. В работе использовали точный тест Фишера на отбор, тест Таджимы на нейтральность. Для оценки а-параметра Z-распределе-ния использовали программу GZ-Gamma [17], для построения Minimum Spanning Network - программу TSC [18]. При оценке длин ветвей дендрограмм Neighbor-Joining использовали метод Branch-Length и программу LINTREE (for DOS) Такезаки [19].
РЕЗУЛЬТАТЫ
В среднем длина изученной последовательности у видов группы D. virilis составила 272 пн, что соответствует 12% длины всего гена, включая 5'-и З'-некодирующие районы, или 39% длины кодирующей последовательности гена (192 пн). Длина гомологичной последовательности D. melano-gaster составляет 348 пн, отличаясь от последовательностей исследуемых видов-близнецов группы D. virilis наличием коротких ин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.