МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 6, с. 760-766
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.253.2;577.218
РОЛЬ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ В АДАПТАЦИИ БАКТЕРИЙ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ РОСТА
© 2010 г. Ю. А. Николаев1, И. А. Борзенков, А. Л. Тарасов, Н. Г. Лойко, А. Н. Козлова,
В. Ф. Гальченко, Г. И. Эль-Регистан
Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
Поступила в редакцию 22.12.2009 г.
В работе продемонстрировано адаптогенное действие химических аналогов внеклеточных ауторегулято-ров бактерий, алкилоксибензолов (АОБ) (индивидуального соединения С7-АОБ и его технического препарата "Сидовит") в отношении двух видов псевдомонад — Pseudomonas aeruginosa и P. fluorescens. Обнаруженный защитный эффект АОБ выражался в увеличении скорости роста и накопления биомассы бактерий при их развитии в неоптимальных для роста условиях в диапазоне толерантности для вида. Адаптогенная эффективность АОБ (10—50 мкг/мл) была тем выше, чем более неблагоприятны были условия роста бактерий. Индивидуальное соединение С7-АОБ на 30% повышало выход биомассы P. flu-orescens при защелочении среды (рН 9.5), когда скорость роста культуры была снижена на 80—90% по сравнению с оптимальными значениями рН (рН 5.5—7.5). Препарат "Сидовит", содержащий смесь природных АОБ с доминирующим компонентом С7-АОБ, на 40—60% повышал скорость роста P. aeruginosa при неоптимальных температурах (45 °С или 10°С) или в условиях повышенной солености (1% NaCl). Одним из механизмов адаптогенного действия АОБ является их функционирование как регуляторов экспрессии стрессовых регулонов rpoS и SOS-ответа, что показано с применением соответствующих репор-терных генов на модельных штаммах E. coli C 600 thi, thr, leuA(pro-lac) с гибридными оперонами osmE-lacZ и umuD-lacZ соответственно. Технологически и экономически целесообразно использовать АОБ в качестве адаптогенных добавок к бактериальным препаратам, применяемым для биоремедиации почв и ликвидации нефтяных проливов в условиях, неоптимальных для развития микроорганизмов: повышенной солености, экстремальных рН, непостоянных суб- и супраоптимальных температурах.
Ключевые слова: бактерии, стресс, адаптация, алкилоксибензолы, протекторы, эффективность бак-препаратов, биоремедиация почв.
Ранее было показано влияние микробных алкилоксибензолов (АОБ) на повышение устойчивости различных микроорганизмов про- и эукариот в условиях окислительного и температурного стрессов сублетальной и летальной интенсивности и шокового воздействия [1, 2]. При этом мало исследованным остается вопрос о влиянии адаптогенов и, в частности, АОБ, на развитие микроорганизмов в условиях, постоянно неоптимальных для роста по какому-либо физико-химическому параметру (температуре, рН, солености и т.д.). Положительный эффект АОБ на улучшение показателей роста микробных культур в зоне экстремума был продемонстрирован только в одном случае — при росте дрожжей в гиперосмотических условиях [3].
Протекторное действие АОБ, приводящее к снижению гибели клеток, связано, с одной стороны, с их антиоксидантными функциями, вследствие чего в клетке снижается уровень активных форм кислорода [4, 5]. С другой стороны, АОБ обладают способностью модифицировать структуру биополимеров, что в отношении ферментных белков приводит к
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: nikolaevya@mail.ru).
повышению их активности, функциональной и операционной стабильности в широком диапазоне неоптимальных для катализа условий [6—8]. Стрессо-защитное действие АОБ также обусловлено их способностью взаимодействовать с фосфолипидами мембран, вызывая структурную реорганизацию ли-пидной стромы мембран и влияя на степень ее ригидности, что отражается на функциональной активности [8, 9], а также способностью взаимодействовать с ДНК, повышая ее устойчивость к денатурирующим воздействиям [9, 10].
Была установлена зависимость протекторного действия АОБ от их структуры и концентрации [1, 3]. Поскольку перечисленные механизмы действия АОБ в повышении устойчивости клеток к повреждающим воздействиям представляются универсальными, было интересным проверить возможность адаптогенного действия АОБ при развитии бактериальных культур в неоптимальных, рост-замедляю-щих условиях, которые имеют место в естественной среде обитания микроорганизмов. Следует отметить, что проблема адаптации микроорганизмов к стрессу имеет не только фундаментальное, но и большое прикладное значение, связанное с приме-
нением бактериальных препаратов различного состава и назначения в неоптимальных для роста микроорганизмов условиях. Такие условия имеют место, например, при силосовании, использовании средств защиты растений, при биоремедиации почв и очистке объектов окружающей среды, загрязненных ксенобиотиками и нефтепродуктами.
Целью работы было исследовать влияние алкил-оксибензолов, как индивидуальных соединений, химических аналогов микробных ауторегуляторов, так и технического препарата АОБ, на стрессоустой-чивость и расширение диапазона активного роста псевдомонад, развивающихся в условиях повышенного содержания NaCl, супра- и субоптимальных значений рН и температуры как факторов, наиболее часто встречающихся в природных системах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования служили широко распространенные в природе бактерии Pseudomonas flu-orescens (штамм NCIMB 9046) и P. aeruginosa (штамм 202, получен от И.А. Борзенкова ИНМИ РАН). Бактерии выращивали в жидкой среде М9 [11] с глюкозой (2 г/л) или ацетатом (1 г/л), во флаконах объемом 60 мл (20 мл среды) на круговой качалке (180 об/мин). Инокулят — стационарную культуру, вносили в количестве 2—5% об. При выращивании бактерий значения рН, температуру и концентрацию NaCl варьировали согласно условиям эксперимента.
В качестве адаптогенов использовали препараты индивидуальных алкилоксибензолов, амфи-фильный С7-АОБ и гидрофобный С12-АОБ (99% чистоты, синтезированные в МГУТХТ) и технический препарат Сидовит (ООО "Новые технологии"), содержащий 65% С7-АОБ и более длинно-цепочечные АОБ.
О влиянии АОБ на развитие микроорганизмов судили по: 1) интенсивности дыхания (выделению СО2, определяемому на инфракрасном анализаторе "Инфралит" (Германия)), 2) численности колоние-образующих единиц (КОЕ), при высеве аликвот культур на плотную среду МПА. При измерении интенсивности дыхания клеток флаконы с культурами продували воздухом, пропущенным через 20% раствор КОН для удаления СО2, герметично закрывали резиновыми пробками, инкубировали 1—3 ч, в зависимости от фазы роста культуры, и определяли количество образовавшегося углекислого газа. Интенсивность дыхания в расчете на 20 мл культуры, находящейся во флаконе, выражали в мкг С-СО2/ч. Предварительно было установлено, что в растущей культуре в интервале времени 1—3 ч накопление СО2 имеет линейный характер, поэтому интенсивность дыхания считали прямо пропорциональной накопленной биомассе (урожаю). Скорость роста выражали как прирост скорости дыхания за сутки (мкг С-СО2/ч х 20 мл культуры х сут).
Регуляторные свойства АОБ исследовали методом репортерных генов. На основе бактерий Escherichia coli C600 thi, thr, leu A(pro-lac) были сконструированы тестерные (репортерные) штаммы [12], содержащие гибридные опероны osmE-lacZ (ген osmE кодирует стресс-индуцибельный липопротеин наружной мембраны, входит в rpoS-регулон стационарной фазы) или umuD-lacZ (ген umuD кодирует низкоточную полимеразу polY, входит в оперон SOS-ответа). Гибридные опероны были встроены в малокопийный транскрипционный вектор pJEL250, содержащий также детерминант устойчивости к ампициллину, и трансформацией перенесены в клетки E. coli. Сконструированные штаммы um250 (E. coli С600 thi, thr, leu A(pro-lac)/pJEL250AmpRumuD-lacZ) и о8250 (E. coli С600 thi, thr, leu A(pro-lac)/pJEL250AmpRosmE-lacZ) позволяли оценивать влияние адаптогенов на экспрессию генов SOS-ответа и rpoS-регулона соответственно. При экспрессии гибридных оперонов osmE-lacZ и umuD-lacZ в клетках этих штаммов накапливается фермент р-галакгозидаза, удельную активность которого (отнесенную к единице ОП культуры) определяли с помощью стандартной методики по расщеплению субстрата о-нитрофенил-р-галактопира-нозида с образованием окрашенного продукта, регистрируемого спектрофотометрически. За единицу активности р-галактозидазы принимали такое количество фермента, которое давало увеличение ОП при 420 нм на 1 ед за 1 мин [13].
Бактерии E. coli выращивали на среде LB [11], содержащей ампициллин (50 мкг/мл), в колбах объемом 250 мл (50 мл среды) при 30°С на качалке (160 об/мин). Инокулят, стационарную культуру, вносили в количестве, дающем начальную оптическую плотность 0.2 (Specord, X = 650 нм, l = 10 мм).
В вариантах определения влияния АОБ на стрессовые реакции бактерий в аликвоту тест-культуры E. coli экспоненциальной (штамм um250) или стационарной (штамм о8250) фаз роста вносили препарат АОБ (водный раствор) до требуемой концентрации, после чего пробу инкубировали в статических условиях при температуре 28°С в течение 80 мин. Затем клетки отделяли центрифугированием (5000 g, 15 мин), дважды отмывали Z-буфером и определяли в них активность р-галактозидазы [13]. В экспериментах по определению протекторного действия АОБ пробы штамма um250 предынкубировали 1 ч с АОБ в статических условиях, после чего подвергали ультрафиолетовому облучению в течение 10 мин (УФ-лампа ДБ 30-1W, расстояние до источника облучения 0.8 м). После облучения пробы выдерживали в течение 10 минут и затем определяли в клетках активность р-галактозидазы как описано выше. В экспериментах со штаммом о8250 после 1-часовой предынкубации с АОБ в пробы вносили NaCl до концентрации 1.5%, выдерживали в течение 20 мин и затем определяли в клетках активность р-галакто-зидазы как описано выше. В контрольных вариантах
мкг С-СО2/ч сут (а)
мкг С-СО2/ч (б) % NaCl
% NaCl
Рис. 1. Влияние препарата Сидовит (10 мг/л) на скорость роста (а) и урожай биомассы (б) P. aeruginosa при разных концентрациях NaCl. 1 — без Сидовита, 2 — с добавлением Сидовита.
пробы предынкубировали с равным объемом растворителя (воды).
Стати
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.