ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2009, том 56, № 4, с. 635-640
КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ
УДК 581.1
РОЛЬ Р-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ В ПОВЫШЕНИИ УСТОЙЧИВОСТИ АгаЫйорБ{Б МаНапа К КАДМИЮ
© 2009 г. Ш. Ц. Као, Г. Рэн, Л. Цзян, X. Б. Юйань, Г. X. Ма
Школа биотехнологии и пищевой инженерии, Хэфейский технологический университет,
Хэфей, Аньхой, Китай Поступила в редакцию 25.11.2007 г.
Обработка проростков Arabidopsis гНаНаиа (Ь.) ИеупЬ. Р-аминомасляной кислотой (АМК) существенно снижала подавление роста корней, вызываемое С^-индуцируемым стрессом. Большой разницы в содержании Cd у обработанных АМК и необработанных АМК растений при С^стрессе не обнаружили. Обработка бутионинсульфоксимином, ингибитором биосинтеза глутатиона, снимала вызванное АМК повышение устойчивости к Cd. Кроме того, уровень транскриптов Б8Н1 и АхАТЫЗ в обработанных АМК растениях был несколько выше, чем в обработанных водой растениях в условиях Cd-стресса. Наши результаты позволяют предположить, что АМК защищает А. хкаНана от действия Cd-стресса по глутатион-зависимому пути.
Ключевые слова: Arabidopsis ЛаНат - Р-аминомасляная кислота - устойчивость к Cd - глутатион
ВВЕДЕНИЕ
Кадмий является долгоживущим в окружающей среде тяжелым металлом, высоко токсичным для растений и животных [1]. Он легко поступает в растение через корни и переносится в стебель. Накопление Cd в высоких количествах в растении сильно подавляет рост и даже приводит к смерти, снижая активность некоторых ферментов, интенсивность фотосинтеза, дыхания, транс-пирации и поглощения элементов питания [1, 2].
Глутатион (GSH) - основное тиоловое соединение небелковой природы, выполняющее множественные функции в метаболизме растений. Например, GSH участвует в детоксикации некоторых тяжелых металлов [3, 4]. Мутант араби-допсиса со сниженной способностью синтезировать GSH, cad2, обладает гиперчувствительностью к кадмию и меди [5]. Однако повышение уровня GSH не всегда коррелирует с повышением устойчивости к тяжелым металлам [6], возможно потому, что сам по себе GSH не всегда способен обеспечить сложный механизм устойчивости к стрессам, вызванным разными тяжелыми металлами [7], включающий удаление тяжелых металлов из цитозоля или их хелатирование, связывание с разными тиоловыми соединениями в цито-золе и их транспорт в вакуоли. В этом процессе
Сокращения: АМК - Р-аминомасляная кислота, БСО - бу-тионинсульфоксимин; GSH - глютатион восстановленный. Адрес для корреспонденции: S.Q. Cao. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, 193 Tunxi Road, Hefei, Anhui 230009, China. E-mail: shuqing. cao@163.com
могут участвовать и другие антиокислительные и восстановительные механизмы [8].
Небелковая Р-аминомасляная кислота (АМК) выполняет несколько функций в ответных реакциях растений [9-12]. В одних случаях, например, у Ага-bidopsis, АМК действует через защитные механизмы с участием салициловой кислоты [12]. В других случаях АМК активирует передачу сигнала от АБК [13]. Кроме того, редко встречающаяся в растениях АМК может защитить растения араби-допсиса от абиотических стрессов, таких как засуха, засоление [9, 10] и высокая температура [11]. Однако остается неясным, играет ли АМК какую-то роль в устойчивости к Cd у арабидопсиса. В настоящей работе мы изучали защитную роль АМК при Cd-индуцированном стрессе у араби-допсиса.
МЕТОДИКА
Растительный материал и условия выращивания. Семена Arabidopsis ХкаНаиа (Ь.) ИеупИ. дикого типа, экотипа ^¡отЫа^, стерилизовали и помещали в чашки на МС среду [14], содержавшую 1 % сахарозу. Через 3 дня роста проростков в темноте при 4°С чашки переносили в ростовую камеру с 22°С, интенсивностью освещения 100 мкмоль/(м2 с), в условия длинного дня (16-часовой фотопериод). Для опытов со взрослыми растениями семена высевали в горшки, заполненные смесью торф : вермикулит : перлит (3 : 9 : 0.5), предварительно пропитанной питательной средой [15].
Обработки и тест на устойчивость к Cd. Проростки выращивали в асептических условиях на МС-среде в течение 5 дней; обрабатывали их водой или 200 мкМ АМК ("Sigma", США), выдерживая корни в растворах в течение 1 дня; 6-дневные проростки размещали вертикально в чашках с агаризованной МС-средой (0.5 нормы) с добавлением 100 или 150 мкМ CdCl2 ("Sigma") или без него. Через 4 дня часть растений брали для измерения длины корней, содержания Cd или ОТ-ПЦР. Считается, что длина корня является надежным показателем устойчивости к тяжелым металлам [16].
Пятинедельные растения, растущие в горшках с почвой, опрыскивали водой (контроль) или 300 мкМ АМК в течение 1 дня. Затем растения обрабатывали 300 мкМ CdCl2 и через 8 дней определяли их сырой вес.
В опытах с бутионинсульфоксимином (БСО) за 1 день до стресса проростки обрабатывали водой (контроль) или 200 мкМ АМК. Шестидневные проростки размещали вертикально в чашках с агаризованной МС-средой (0.5 нормы) с добавлением 100 мкМ CdCl2 или без него в отсутствие или в присутствии 200 мкМ БСО. Через 4 дня определяли длину корней.
Определение содержания Cd. Содержание Cd определяли в соответствии с методикой Kim с со-авт. [17]. Вкратце, проростки собирали, промывали трижды ледяной водой и выдерживали в 11 N HNO3 при 200°С в течение ночи. "Вываренные" образцы разбавляли 0.1 N HNO3 и анализировали в них содержание Cd на атомном абсорбционном спектрофотометре.
ОТ-ПЦР-анализ экспрессии генов. Проростки растирали в ступке в жидком азоте. РНК экстрагировали, используя Trizol реагент ("Invitrogen", США), с последующей экстракцией хлороформом, осаждением изопропанолом и количественным анализом на спектрофотометре. кДНК синтезировали на РНК, обработанной ДНКазой, с помощью обратной транскриптазы Superscript ("Invitrogen"), в соответствии с рекомендацией производителя. Продукты кДНК были стандартизованы для полуколичественного ОТ-ПЦР-анализа с использованием праймеров Р-актина для получения стандарта. Для каждого транскрипта были сконструированы специфичные 5' и 3' праймеры с температурой плавления между 52 и 60°С. Количество циклов было подобрано эмпирически для оптимального обнаружения различий в числе транскриптов.
Для амплификации ген-специфических транскриптов использовали следующие праймеры:
АСШ11 (АСТШ, А13§12110): прямой, 5'-ОАТТТ-ОООАТС АС АСТТТСТАС ААТО-3' и обратный, 5'-ОТТССАССАСТОАООАСААТО-3'; 08И1 (А14§23100): прямой, 5'-АТСТАСОСТТТО-ТССССАТТС-3' и обратный, 5'-АТАТТСССА-ОАООТТОООТО-3';
АгАТЫЗ (А^58270)Ж прямой 5'-ТОСТСООА-САТТТТШАААТС-3' и обратный 5'-ОТССАТ-АОСТОСОСАТАТСТС-3'.
Статистический анализ. Представлены средние арифметические из трех повторностей и их стандартные ошибки. Для определения значимых различий между вариантами использовали АКОУА. Сравнение индивидуальных значений и их разброс проводили с использованием Дункан-теста.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Повышение устойчивости к Сё у растений арабидопсиса после обработки АМК
Проростки арабидопсиса после обработки водой или 200 мкМ АМК выращивали на МС-среде, после чего их тестировали на устойчивость к Сё. На рис. 1а и 16 отчетливо видно, что после воздействия 150 мкМ СёС12 на контрольные проростки (предобработанные водой) удлинение корней у них полностью прекращалось в отличие от контрольных проростков без СёС12. Однако подавление роста корней кадмием полностью снималось обработкой АМК.
Растения арабидопсиса, выращенные в горшках с почвой, также тестировали на чувствительность к Сё после обработки АМК (рис. 1в и 1г). При нормальных условиях (без Сё-стресса) обработанные АМК (300 мкМ) растения выглядели так же, как и обработанные водой. Однако при стрессе устойчивость к Сё у обработанных АМК растений повышалась по сравнению с обработанными водой растениями.
Влияние обработки АМК на накопление Сё в растениях при Сё-стрессе
Как показано на рис. 2, при Сё-стрессе содержание Сё в обработанных АМК и водой растениях было одинаковым. Эти результаты исключают возможность того, что усиление устойчивости к Сё-стрессу после обработки АМК сопряжено со снижением накопления и поглощения Сё.
АМК-индуцированная устойчивость к Сё является 0$>И-зависимой
ОБИ предохраняет клетки растений от окислительного стресса [18] и важен для детоксикации Сё [3-5]. Чтобы выяснить, связан ли механизм
РОЛЬ Р-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ В ПОВЫШЕНИИ УСТОЙЧИВОСТИ 637
(а) (в)
АМК вода
0 '—-------L- 01—1-------L-
вода АМК CdCl2 CdCl2 + вода АМК CdCl2 CdCl2 +
+ АМК + АМК
Рис. 1. Повышение устойчивости к Cd у растений арабидопсиса после обработки АМК.
а - симптомы Cd-стресса у проростков арабидопсиса, растущих на МС-среде. После 5 дней роста проростков на МС-среде корни в течение 1 дня обрабатывали водой или 200 мкМ АМК. Затем проростки росли в отсутствие или в присутствии 150 мкМ CdCl2 в течение 4 дней. Представлены репрезентативные результаты; б - влияние АМК на длину корней проростков, растущих, как показано на фото (а); в - симптомы Cd-стресса у растений арабидопсиса, растущих в горшках с почвой. 5-недельные растения опрыскивали в течение 1 дня водой или 300 мкМ АМК, а затем 300 мкМ CdCl2 в течение 8 дней. Представлены репрезентативные результаты; г - влияние АМК на сырой вес растений, растущих, как показано на фото (в).
устойчивости к Сё у обработанных АМК растений с ОБИ, мы сравнили интенсивность роста обработанных водой и АМК проростков в среде, содержавшей БСО, ингибитор у-глутамилцистеин-синтетазы. При выращивании в МС-среде добавление только 200 мкМ БСО не подавляло рост обработанных водой или АМК проростков (рис. 3а и 36). Однако если БСО добавляли вместе с 100 мкМ СёС12, то положительный эффект АМК на рост корней, подавленный при Сё-стрес-се, исчезал (рис. 3а и 36). Эти результаты означают, что устойчивость к Сё, вызываемая АМК, связана с ОБИ.
Для дальнейшего выяснения, связано ли вызываемое АМК повышение устойчивости к Сё с активацией генов, вовлекаемых в ОБИ-зависи-
мый путь, изучили уровень транскриптов ОБШ1, кодирующих ферменты, вовлеченные в синтез ОБИ [3], и уровень генов АхАТМЗ, контролирующих уровень ОБИ [17] (рис. 4). После обработки растений 100 мкМ СёС12 уровни транскриптов ОБШ1 и АхАТМЗ в обработанных АМК растениях были выше
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.