РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2011, том 5(14), № 2, с. 135-139
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
РОЛЬ CD40-ЗАВИСИМОГО СИГНАЛА В ИНДУКЦИИ РЕКОМБИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ а|ЗТ-ЛИМФОЦИТАХ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ
© 2011 г. Н.С. Глебездина, Е.М. Куклина, С.В. Ширшев
Учреждение Российской академии наук — Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь, Россия
Поступила: 27.02.2011. Принята: 22.04.2011
Исследованы механизмы индукции экстратимической реаранжировки генов Т-кле-точного рецептора при беременности, а именно — участие мембранной молекулы CD40 в активации рекомбиназ как маркеров реаранжировки. Выявлено присутствие С040-позитивных Т-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах беременных мышей. Показано, что локализация данной Т-клеточной популяции аналогична таковой для рекомбиназ RAG-1 и RAG-2, продемонстрированной нами ранее. Тем не менее анализ экспрессии арТ-клетками RAG-1 в зависимости от присутствия на мембране CD40, а также при направленной CD40-зависимой активации Т-клеток in vitro показал, что сигнал с CD40, по-видимому, не играет ключевой роли в индукции рекомбиназной активности.
Ключевые слова: беременность, Т-лимфоциты, CD40, экстратимическая дифференци-ровка
ВВЕДЕНИЕ
Недавними исследованиями мы показали, что реаранжировка генов Т-клеточного рецептора (T Cell Receptor, TCR) в период беременности может происходить не только в тимусе, как предполагалось ранее, но и в периферических органах иммунной системы [1, 2]. В частности, мы выявили экспрессию ключевых факторов реаранжировки, рекомбиназ RAG-1 и RAG-2 (Recombination Activating Genes 1, 2) в периферических а^Т-клетках беременных мышей, причем преимущественно — в дренирующих матку лимфатических узлах. Полученные данные подняли вопрос о том, какие факторы участвуют в индукции экстратимической реаранжировки генов Т-клеточного рецептора при беременности?
Наиболее вероятный кандидат на эту роль — мембранная молекула CD40, которая, предположительно, экспрессируется Т-лимфоцита-ми при беременности и участвует в передаче сигнала к такой реаранжировке. Для данной гипотезы есть как минимум два основания.
Адрес: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. E-mail: glebezdina_n@mail.ru
Во-первых, в периферических В-лимфоци-тах именно сигнал с молекулы CD40 запускает экспрессию рекомбиназ, с помощью которых в зрелых В-клетках идет переключение классов иммуноглобулинов [3]. Во-вторых, у мышей линии NOD (Non Obese Diabetic), для которых характерно наличие процессов реа-ранжировки генов в периферических Т-лим-фоцитах, до 60% периферических Т-клеток несут на мембране эту не типичную для них молекулу [4]. В связи с этим целью настоящей работы было изучение экспрессии молекулы CD40 на а^Т-лимфоцитах периферических лимфоидных органов беременных мышей, а также возможного вклада данной молекулы в индукцию реаранжировки генов Т-клеточно-го рецептора на периферии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования
В работе использовали беременных (10 — 11 день) мышей Swiss. Беременность фиксировали по появлению вагинальной пробки. Животных выводили из эксперимента методом цервикальной дислокации. Исследовали лим-
Таблица 1. Экспрессия С040 арТ-лимфоцитами периферических лимфоидных органов и тканей мышей при беременности
Процент CD40 + -клеток в по-
Периферические пуляции apT-лимфоцитов
органы/ткани Небеременные Беременные
мыши (n = 16) мыши (n = 13)
Перифериче- 0,42 ± 0,08 0,47 ± 0,15
ская кровь
Селезенка 1,51 ± 0,23 3,05 ± 0,42
Парааортальные 0,87 ± 0,15 5,33 ± 0,59*
лимфатические
узлы
Подмышечные 0,87 ± 0,08 3,55 ±0,46*
лимфатические
узлы
Паховые 0,51 ± 0,06 0,76 ± 0,08
лимфатические
узлы
*p < 0,05 — в сопоставлении с соответствующим показателем для небеременных мышей
фоциты периферической крови, селезенки и лимфатических узлов (отдельно дренирующих матку — парааортальных, и не дренирующих — паховых и подмышечных). Клетки лимфоидных органов выделяли гомогенизацией, лейкоциты — центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (1,077 г/см3). Для цитометрического анализа использовали нефракционированную клеточную суспензию.
Методы исследования
Наличие процессов реаранжировки определяли по экспрессии в клетках рекомбина-зы RAG-1. Этот фермент обладает нуклеазной активностью и именно поэтому является ключевым в процессе реаранжировки [1, 5], в то время как RAG-2, предположительно, нужна для стабилизации связывания RAG-1 с ДНК [6], и ее присутствие не является необходимым условием для реаранжировки [1, 5]. Экспрессию внутриклеточного белка RAG-1, а также мембранных молекул a^TCR (антигенного рецептора) и CD40 на периферических аРТ-лимфоцитах оценивалали проточной цитометрией с помощью соответствующих моноклональных антител: anti-RAG-1 (H 300) («Santa Cruz Biotechnology») + anti-rabbit IgG • PE-Cy5.5 («Invitrogen»), apTCR • FITC («Invitrogen»), анти-CD40 • PE («Invitrogen»).
Внутриклеточное окрашивание RAG-1 проводили с использованием набора фиксирую-щего/пермеабилизирующего буферов («Biolegend») в соответствии с рекомендациями производителя. Пробы анализировали на проточном цитометре Becton Dickinson FACS-cal-ibur, для обработки результатов использовали программу CellQuest («Becton Dickinson»). Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента.
В ряде экспериментов для разделения клеточных конгломератов выделенные клетки перед проведением цитометрического анализа инкубировали в 0,5 мМ EDTA.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Установлено, что у мышей Swiss на 10—11 день беременности в парааортальных лимфатических узлах, дренирующих матку, а также, в меньшей степени, в подмышечных лимфоузлах регистрируется нетипичная популяция арТ-лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CD40. Данная популяция отсутствует у небеременных мышей, а также у беременных в периферической крови, селезенке и паховых лимфоузлах, не дренирующих матку (Табл. 1). Размер популяции apТСR+CD40 + -клеток невелик, однако отличие принципиальное — у небеременных мышей она практически не выявляется. В таблице 1 приведены данные для классического пула лимфоцитов. Однако для парааортальных и подмышечных лимфатических узлов, а также для селезенки беременных мышей справа от классической популяции лимфоцитов регистрировалось дополнительное клеточное облако (Рис. 1А, гейт R2), размер которого составлял в среднем 16,4 ± 2,09% от общего количества лимфоцитов для селезенки и 11,2 ± 1,60% для лимфоузлов. Анализ коэкспрессии CD40 и aPTCR в этом неклассическом лимфоцитарном пуле (гейт R2) показал, что значительная часть Т-клеток несет молекулу CD40 (Рис. 1). Наиболее выражен данный показатель был в па-рааортальных лимфатических узлах — 35,80 ± 3,31% apТСR+CD40 + -клеток от общего числа аРТ-лимфоцитов, и несколько ниже — в селезенке (11,90 ± 2,23%) и подмышечных лимфоузлах (23,60 ± 3,30%).
Учитывая, что наличие aPTCR+CD40 + -объектов вне классического лимфоцитарно-го пула может быть связано с образованием конгломератов Т- и В-лимфоцитов, ряд экспериментов по оценке коэкспрессии на клетках
Беременность и СВ40+а$Т-лимфоциты
137
FSC
10° Ï01 lÖ2 103
TCR ИТС
101 102 103 ю4
TCRFTTC
FSC
101 102 103 TCR ИТС
101 102 103 TCRFTTC
Рис. 1. Коэкспрессия сфТСЯ и СБ40 различными субпопуляциями клеток лимфатических узлов беременных мышей.
Верхний ряд: лимфоциты парааортальных лимфатических узлов; нижний ряд: клетки подмышечных лимфатических узлов. А — диаграмма распределения клеток лимфатических узлов по параметрам переднего и бокового светорассеяния, гейтом выделен классический пул лимфоцитов, гейтом И2 — неклассическое облако лимфоцитов; В — двухпараметрический график распределения клеток из классического лимфоцитарного пула (гейт И1) по уровню экспрессии арТСИ и СБ40; С — двухпараметрический график распределения клеток из неклассического облака лимфоцитов (гейт И2) по уровню экспрессии арТСИ и СБ40.
CD40 и аpТСR проводили в хелатирующих условиях (ЭДТА) и показали, что неклассическое лимфоцитарное облако при этом не исчезает и процент CD40-позитивных Т-кле-ток в нем существенно не изменяется: для парааортальных лимфатических узлов размер популяции apTCR+СD40 + -клеток составлял 29,00 ± 3,92%, для подмышечных — 21,90 ± 4,64%. Вероятнее всего, объекты вне классического лимфоцитарного пула — это пролиферирующие клетки, причем высокий процент CD40-позитивных Т-лимфоцитов в данной популяции имеет логичное объяснение. Так, на модели аутоиммунного диабета, для которого характерна экспрессия CD40 на части Т-лимфоцитов, как у мышей NOD, так и у пациентов с соответствующей патологией, показано, что CD40-зависимая костимуляция усиливает пролиферацию Т-клеток, индуцированную антигеном — за счет повышения продукции IL-2, усиления экспрессии CD25, а также подавления активности ингибитора пролиферации — CTLA-4 [7].
Важно отметить, что экспрессия молекулы CD40 Т-лимфоцитами беременных мышей имела те же закономерности распределения, что и экспрессия рекомбиназ в этих клетках, как на уровне мРНК (для RAG-1 и RAG-2) [2], так и (для RAG-1) на уровне белка (Рис. 2): наиболее четко и воспроизводимо она выявлялась в парааортальных лимфатических узлах, дренирующих матку.
Следующим этапом работы была оценка возможной роли CD40-зависимого сигнала в индукции рекомбиназной активности в Т-клетках периферических лимфоидных органов беременных мышей.
Анализ экспрессии рекомбиназы RAG-1 в периферических Т-лимфоцитах парааортальных лимфоузлов в зависимости от наличия или отсутствия на мембране CD40 не выявил четких закономерностей: рекомбина-за выявлялась как в aßTCR+СD40 + -клетках (5,40 ± 0,81% RAG-1 + -лимфоцитов от общего числа aßТСR+CD40 + -клеток), так и в классической, CD40-негативной популяции Т-лим-
кровь лимфати- лимфати- ческие
ческие ческие узлы узлы узлы
Рис. 2. Экспрессия белка RAG-1 aßT-лимфоцитами периферических лимфоидных органов и тканей мышей при беременности.
Незаштрихованные столбцы — небеременные животные, заштрихованные — беременные (10 — 11 сутки); *p < 0,05 (в сопоставлении с соответствующим показателем для небеременных мышей).
фоцитов (3,90 ± 0,76% RAG-1 + -лимфоцитов о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.