= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ =
УДК 581.1.581.14
РОЛЬ ЭТИЛЕНА В РЕГУЛЯЦИИ ГАМЕТОФИТНО-СПОРОФИТНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ПРОГАМНОЙ ФАЗЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ У ПЕТУНИИ (PETUNIA HYBRIDA L.) © 2013 г. Л. В. Ковалева, Г. В. Тимофеева, Г. Б. Родионова, Е. В. Захарова, В. Ю. Ракитин
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева 127276 Москва, ул. Ботаническая, д. 35 E-mail: kovaleva_l@mail.ru Поступила в редакцию 16.11.11 г. Окончательный вариант получен 19.01.12 г.
Исследовали динамику содержания 1-аминоциклопропан 1-карбоновой кислоты (АЦК) и образования этилена в процессе развития и прорастания мужского гаметофита петунии трех клонов (стерильного, самосовместимого и самонесовместимого). Развитие мужского гаметофита у фертильных клонов сопровождалось двумя максимумами содержания АЦК и выделения этилена в системе пыльник—мужской гаметофит. Первый сопровождал развитие микроспор, разрушение тапетума и средних слоев стенки пыльника, второй — дегидратацию и созревание пыльцевых зерен. Пыльники стерильного клона уже на стадии мейоза выделяли в 10 раз больше этилена, чем пыльники фертильных клонов, что приводило к разрушению тапетума и гибели микроспороцитов. Обработка этиленом (1 — 100 мкл/л) бутонов фертильных клонов на стадии мейоза мужского гаметофита также вызывала гибель генеративных клеток. Накопленная во время дегидратации и созревания в пыльцевых зернах АЦК расходовалась на синтез этилена при их прорастании. Всплеск выделения этилена сопровождал прорастание мужского гаметофита как на среде культивирования, так и на поверхности рыльца. Основным местом синтеза этилена в опыленном пестике были ткани рыльца. Прорастание мужского гаметофита после совместимого опыления сопровождалось более высоким содержанием АЦК, но менее интенсивным образованием этилена, чем после несовместимого опыления. Более интенсивное образование этилена после самонесовместимого опыления вызывало торможение роста пыльцевых трубок в проводниковых тканях столбика. Ингибитор действия этилена 2,5-норбор-надиен (NBD) блокировал как развитие, так и прорастание мужского гаметофита. Полученные данные показывают, что этилен участвует в регуляции развития, прорастания и роста мужского гаметофита в прогамной фазе оплодотворения.
Ключевые слова: этилен, мужской гаметофит, дифференциация, прорастание, рост, стерильность, самонесовместимость, петуния.
DOI: 10.7868/S0475145013020055
В настоящее время накапливается все больше данных об участии этилена в регуляции репродуктивного процесса растений (Kende, 1993; Woltering et al., 1995; Liu et al., 1999; Bleecker, Kende, 2000; Alexander, Grierson, 2002; Butenko et al., 2006; Trusov, Botella, 2006; Achard et al., 2007; Xue et al., 2008; Lin et al., 2009).
Показано, что трансгенные растения петунии со сниженной экспрессией гена PHEIN2 проявляли низкую чувствительность к этилену при старении цветков и созревании плодов (Shibuya et al., 2004), а сверхэкспрессия в трансгенных растениях табака гена Cm-ETR1/H69A или Cm-ERS1/H70A индуцировала стерильность пыльцы или снижала ее фертильность (Ishimaru et al., 2006).
LM-array (laser microdissection technique) анализ профиля глобальной экспрессии генов в развивающемся пыльнике риса выявил наличие синтеза и сигналинга этилена в микроспорах, пыльцевых зернах и тапетуме, в частности выявил экспрессию АЦК-синтазы6 (ACS6), АЦК-оксидазы2 (ACO2) и АЦК-оксидазыЗ (ACO3) на последних стадиях развития пыльцевого зерна, что указывало на то, что эти стадии характеризуются активным синтезом этилена (Hirano et al., 2008).
Опыление у многих растений инициирует каскад событий, включающих в себя образование этилена, способного координировать дальнейшее развитие цветка (O'Neill et al., 1993). Исследования, проведенные на орхидее, гвоздике, табаке и петунии, предполагают, что индуцированное опы-
лением образование и выделение этилена тканями пестика необходимо для роста пыльцевых трубок и успешного оплодотворения (Hoekstra, Weges, 1986; Singh et al., 1992; Nadeau et al., 1993; Tang et al., 1994; Tang, Woodson, 1996; Bui, O'Neill, 1998; Weterings et al., 2002; Holden et al., 2003; Kovaleva, Zakharova, 2003). Однако вопрос о физиологической роли этилена в гаметофитно-спорофитных взаимодействиях в прогамной фазе оплодотворения как при нормальном развитии репродуктивного процесса, так при наличии генетически детерминированных барьеров самооплодотворения еще далек от своего решения.
Цель данной работы составило изучение образования и действия АЦК и этилена в развивающихся пыльниках самосовместимого, стерильного и самонесовместимого клонов петунии, а также в in vitro прорастающем мужском гаметофите (на среде культивирования) и in vivo в системе пыльца—пестик.
Полученные данные показали, что этилен участвует в регуляции гаметофитно-спорофитных отношений на всех этапах прогамной фазы оплодотворения у петунии. Изменение этой регуляции на генетическом уровне у стерильного и самонесовместимого клонов или экзогенным этиленом и ингибитором его действия NBD у самосовместимого клона приводили к нарушению гаметофит-но-спорофитных взаимодействий и в конечном итоге к блокированию оплодотворения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Вегетативно размноженные растения двух фертильных (самосовместимого и самонесовместимого) и стерильного клонов петунии (Petunia hybrida L.) выращивали в почвенной культуре при естественном освещении в оранжерее.
Самонесовместимый клон характеризуется тем, что при самоопылении его пыльца прорастает на рыльце, но рост пыльцевых трубок останавливается в проводниковых тканях столбика вследствие гаметофитной самонесовместимости. У стерильного клона микроспорогенез останавливается на стадии мейоза (Добровольская и др., 2009).
Самоопыление кастрированных и изолированных накануне раскрытия цветков самосовместимого и самонесовместимого клонов проводили пыльцой, собранной из раскрытых цветков соответствующего клона.
Стадии развития микроспор и пыльцевых зерен в развивающихся пыльниках определяли в соответствии с общепринятой классификацией (Koltunow et al., 1990) по методике Матвеевой и др. (1998). Пыльники извлекали из бутонов длиной от 2.5 до 50 мм, раздавливали пестиком в фиксирующей жидкости (ацетон : 96% этанол, 1 : 1). Полученную взвесь клеток фильтровали через капроновую сет-
ку (поры 40 мкм), центрифугировали 3 мин при 200 g, ресуспендировали в 70% спирте, снова центрифугировали и окрашивали флюоресцентным красителем Hoechst 33258 ("Serva" Германия) для идентификации стадий развития микроспор, основанной на специфичном связывании красителя с ДНК ядер (Матвеева и др., 1998). Для определения каждой стадии использовали пыльники из 15 бутонов. Препараты анализировали под микроскопом Axio Imedger D1 (Carl Zeiss, Германия).
Изучение влияния экзогенного этилена и ингибитора его действия 2,5-норборнадиена (NBD)
на развитие мужского гаметофита петунии самосовместимого клона
Обработка побегов с бутонами этиленом. За 0.5 ч до начала эксперимента побеги с бутонами, находящимися на разных стадиях развития мужского гаметофита, срезали с растений, ставили в стаканы с 100 мл водопроводной воды и помещали в герметичные стеклянные камеры объемом 20 л, снабженные штуцерами для ввода этилена. С помощью шприца вводили этилен, создавая в камерах следующие концентрации: 1, 10 и 100 мкл/л. Обработку побегов с бутонами этиленом проводили в течение трех суток, пробы брали каждые 24 часа. После отбора бутонов и проветривания в камерах создавали необходимые концентрации этилена. В качестве контроля использовали пыльники из бутонов, находившихся в камере без добавления этилена.
Обработку побегов с бутонами и прорастающую на среде культивирования пыльцу NBD проводили в 5-литровых стеклянных камерах при температуре 26°С и 16-часовом фотопериоде с интенсивностью освещения люминисцентными лампами ЛБ-80-8000 люкс. Для создания в камерах концентрации газообразного NBD 500, 2000 и 6000 мкл/л на полоску фильтровальной бумаги, прикрепленной к крышке сосуда, наносили соответственно 12, 48 или 144 мкл жидкого NBD, после чего сосуд немедленно закрывали и герметизировали. Камеры ежедневно проветривали, после чего восстанавливали концентрацию NBD.
Ежедневные наблюдения за состоянием генеративных клеток в пыльниках, обработанных этиленом и NBD, проводили на Hoechst-окрашенных срезах с помощью микроскопа Axio Imedger D1.
Питательная среда для культивирования пыльцы включала 0.4 М сахарозу и 1.6 мМ борную кислоту. О степени прорастания судили по количеству проросших пыльцевых зерен, произвольно отобранных и наблюдаемых в четырех полях микроскопа (n = 200). Длину пыльцевых трубок определяли с помощью микроскопа Axio Imedger D1 с камерой Axio Cam MRc. Измерения выполняли в программе Axio Vizion 4.5 (Carl Zeiss, Германия).
0_I_I_I_I_I_I_I_I_I_
Время, сутки 00.511.5 3 4 6 11 14
Стадия развития МЕ РМ ПМ РПЗ СПЗ ППЗ
Ар Т Ми
Рис. 1. Корреляция между длиной бутона и стадиями развития пыльника и мужского гаметофита петунии фертильного клона. Ар — археспорий, Ме — мейоз, Т — тетрады, РМ — ранние микроспоры, ПМ — поздние микроспоры, Ми — митоз, РПЗ — ранние пыльцевые зерна, СПЗ — средние пыльцевые зерна, ППЗ — поздние пыльцевые зерна.
Выделение этилена определяли газохроматогра-фическим методом (Ракитин В., Ракитин Л., 1986). По 30 пыльников из бутонов одного размера, 20 мг пыльцы + 2 мл питательной среды, 5—7 неопылен-ных или опыленных пестиков или их частей (рылец, столбиков, завязей) помещали в отдельные флаконы объемом 15 мл и герметично закрывали резиновыми пробками (Septa, Red Rubber, O.D. 13 мм, Aldrich, США). Одновременно для контроля исходного уровня этилена в воздухе закрывали пустой флакон. Образцы инкубировали в темноте при 26°С в термостате ТСН 100 (Laboratorni Pris-tole, Прага) не более 30 мин до начала анализа. Весь воздух из флакона использовали для определения содержания этилена на газовом хроматографе Цвет 106 (Россия) с пламенно ионизационным детектором и концентрирующей системой для углеводородов, позволяющей в десятки раз повышать чувствительность прибора, которая необходима для максимального с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.