ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 5, с. 560-569
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ ^
УДК 581.1:577.214:582.951.4
РОЛЬ ГЕНОВ NtEXPAl И NtEXPA4 В РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНОГО РАСТЯЖЕНИЯ ПРИ РОСТЕ ЛИСТЬЕВ ТАБАКА
© 2014 г. Б. Р. Кулуев, А. В. Князев, Ю. М. Никоноров, А. В. Чемерис
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа 450054
e-mail: kuluev@bk.ru Поступила в редакцию 16.09.2013 г.
Гены NtEXPA1 и NtEXPA4 кодируют а-экспансины табака, участвующие в регуляции роста клеток растяжением. Нами проведен анализ уровня экспрессии этих генов в различных органах табака и при экзогенной обработке фитогормонами. Наиболее высокий уровень экспрессии гена NtEXPA1 был зарегистрирован в верхушке побега, в молодых листьях и в растущих цветках, а отсутствие экспрессии — в закончивших рост листьях. Для гена NtEXPA4 был характерен сходный профиль экспрессии, различие заключалось в более высоком содержании его мРНК во всех листьях, только в зрелых листьях экспрессия этого гена снижалась. В молодых листьях, расположенных в районе верхушки побега, повышение уровня экспрессии генов NtEXPA1 и NtEXPA4 индуцировали ауксины. В листьях, расположенных ниже верхушки побега, брассиностероиды уменьшали экспрессию гена NtEXPA1 и повышали экспрессию гена NtEXPA4. Повышение уровня экспрессии гена NtEXPA1 и снижение содержания мРНК гена NtEXPA4 наблюдалось в результате индуцибельной экспрессии гена ARGOS-LIKE. Сверхэкспрессия гена NtEXPA1 способствовала возрастанию размеров листьев и стебля за счет увеличения размеров отдельных клеток.
DOI: 10.7868/S0016675814040067
В результате функционирования апикальной меристемы побега формируются зачатки листьев, которые вначале растут и развиваются в основном за счет клеточных делений. Затем большинство клеток зачатков листьев переходят к стадии роста растяжением, что обеспечивает быстрое увеличение размеров листа. Одновременно в молодых листьях происходит дифференцировка клеток, однако некоторые клетки, называемые меристемоидными, продолжают еще долгое время оставаться в пролиферативной фазе [1]. Таким образом, интенсивно растущие листья развиваются в основном за счет клеточного растяжения и деления меристемоидных клеток. На более поздних стадиях развития листа клетки перестают делиться, и дальнейший рост обеспечивается лишь клеточным растяжением. Процессы, обеспечивающие рост клеток растяжением, происходят в основном в клеточной стенке, состоящей из взаимодействующих между собой микрофибрилл целлюлозы, связующих гликанов, пектинов и структурных белков [2]. Весь каркас стенки держится за счет ковалентных и водородных связей, которые служат мишенью для множества ферментов. Расхождение микрофибрилл при клеточном растяжении достигается тремя основными механизмами: гидролизом части связующих гликанов эндогликаназами; разрезанием и новым сшиванием гликанов ксилоглюканэндотрансгли-козилазами; а также нарушением водородных связей между микрофибриллами целлюлозы и
гликановыми цепями, которое осуществляется экспансинами [3]. В растительных организмах идентифицировано четыре класса белков экспан-синов: а-экспансины, р-экспансины, экспан-син-подобные белки А и экспансин-подобные белки В. Активность экспансинов в основном определяется транскрипцией, а она, в свою очередь, тонко регулируется фитогормональным сигналингом и условиями внешней среды [4]. По нашим данным, в регуляции экспрессии экспансинов также могут быть задействованы транскрипционные факторы подсемейства АР2 [5] и белки с 08Я-доменом, например АЯ008-ЫКЕ [6]. В каждом растении присутствует большое количество разнообразных экспансинов, но лишь у немногих растений они идентифицированы и определены их функции. Например, у ЛгаЪ1йор$15 АаНапа было обнаружено 26 генов а-экспанси-нов и пять р-экспансинов, в геноме риса — 26 генов а- и 14 генов р-экспансинов [4]. Экспансины являются ключевыми факторами во многих мор-фогенетических процессах растений, таких как созревание плода, прорастание пыльцевой трубки, рост корневых волосков, опадение листьев имн. др. [7]. Экспансины принимают участие также и в регуляции роста и развития листовой пластинки. Например, показано, что эктопическая экспрессия гена ТаЕХРВ23 р-экспансина, выделенного из колеоптилей пшеницы (ТгШеыш агзИуиш), приводит к ускоренному росту листьев и междоузлий на ранних стадиях развития расте-
Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе
Назначение праймеров Последовательность нуклеотидов праймеров
Для ОТ-ПЦР гена а-тубулина табака CCAAGGTGCAAAGGGCTGTAT и TTCCTCGTTATCATCGTCTTCTCC
Для ОТ-ПЦР гена NtEXPA1 табака AACATTGGCATTTACAGAGGTG и AAGGGTTGGCCATTGAGATA
Для ОТ-ПЦР гена NtEXPA4 табака TGTAATCCTCCCCTTCACCAT и ATAATTGTTGTTTTGCCAGTTTTG
Для амплификации и клонирования гена NtEXPA1 табака CTTCTTCTTCTTCTGTTGCTTTG и TGAACTCACAAACTCTAAATCCTG
Для определения направленности целевых генов в векторе рСатЫа 1301 ATCAACGGAGAAACAAAGAT и TGCTCTAGCATTCGCCATTC
Для определения направленности целевых генов в векторе рБЯ8 AAGTTCATTTCATTTGGAGAG и TTGCACCTTAATATCACACTG
ний [8]. У A. thaliana сверхэкспрессия гена АЛЕХРЮ способствует увеличению, а подавление экспрессии — уменьшению длины черешков и площади листовой пластинки [7]. Анализ 33 генов экспансинов кукурузы показал, что 19 из них экс-прессируются в разных точках зоны удлинения листа. Это позволило объединить их в три группы, выполняющие следующие функции: растяжение клетки, максимальное расширение листа и дифференцировка клеточных стенок [9].
При создании трансгенных растений одним из излюбленных исследователями модельных объектов является табак. Геном у данного растения пока не секвенирован, но были идентифицированы шесть генов а-экспансинов [10], которые получили названия NtEXPA, с порядковыми номерами от 1 до 6, и их нуклеотидные последовательности имеются в GenBank (AF049350-AF049355). Судя по данным филогенетического анализа [11], экспансины NtEXPA1, NtEXPA2 и NtEXPA3 относятся к субгруппе D, а NtEXPA4 относится к субгруппе С. Однако не один из этих экспансинов должным образом не был изучен, поэтому целью данной работы стало исследование генов двух экспансинов табака NtEXPA1 и NtEXPA4, относящихся к двум разным субгруппам и предположительно выполняющих разные функции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экзогенная обработка табака фитогормонами. Перед экзогенной обработкой фитогормонами контрольные и опытные растения Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana линии SR1 проращивали на среде МС в течение 20 дней в климатической камере Binder (Германия). Затем проростки табака в течение 55 дней выращивали на уни-
версальном грунте (Terra vita, Россия) и опрыскивали всю надземную часть растения раствором фитогормона с добавлением твина (0.1%) при помощи пульверизатора. Использовали следующие концентрации фитогормонов: 6-БАП — 50 мкМ, НУК — 0.5 мкМ, 24-эпибрассинолид — 0.1 мкМ, гибберелловая кислота (ГК3) — 1 мкМ. Через 1.5 ч после опрыскивания вторые и третьи от верхушки побега листья табака замораживали в жидком азоте и выделяли из них тотальную РНК. Контрольные растения опрыскивали 0.1%-ным раствором твина.
Количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Тотальную РНК из листьев исследуемых растений выделяли с тризолом, первую цепь кДНК строили при помощи олиго(ёТ) праймера и MMuLV-ревертазы (NEB, США). Последовательности использованных праймеров представлены в таблице. Количественное определение содержания мРНК (после конверсии в кДНК) генов NtEXPA1 и NtEXPA4 проводили методом полиме-разной цепной реакции в режиме реального времени в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I на термоциклере Rotor-Gene™ 6000 (Corbett Research, Австралия). Расчеты производились по 2хААСметоду [12], используя в качестве стандарта мРНК тубулина, уровень экспрессии которого принимали за 100%. Реакцию амплификации проводили в 0.2 мл пробирках (AXYGEN, Inc., США) в объеме 25 мкл, используя стандартный набор (Синтол, Россия).
Генно-инженерные манипуляции. Ген NtEXPA1 (AF049350) был амплифицирован из геномной ДНК табака при помощи HiFi ДНК-полимеразы (Kapa Biosystems, USA). При создании генно-инженерных конструкций использовали бинарный
вектор pCambia 13G1 (CAMBIA, Австралия), с селективным маркером устойчивости к гигромици-ну, в котором была клонирована искусственно созданная кассета, состоящая из промотора вируса мозаики георгина [13] и сайта полиаденилирова-ния вируса мозаики цветной капусты. Полученную плазмиду расщепляли по сайту рестрикции XbaI, достраивали липкие концы при помощи Т4-ДНК-полимеразы и в полученном бинарном векторе клонировали ген NtEXPA1. По результатам ПЦР-анализа отбирали конструкции, содержащие вставку целевого гена в смысловой ориентации по отношению к промотору (таблица). Трансгенные растения табака с эстрадиол-индуци-бельной экспрессией гена ARGOS-LIKE A. thaliana (DQ369723) получали при помощи бинарного вектора pER8, содержащего ген устойчивости к гигромицину, химерный транскрипционный активатор XVE и сильный промотор G1G-9G [14]. Бинарный вектор pER8 расщепляли по сайту рестрикции XhoI, достраивали липкие концы при помощи Т4-ДНК-полимеразы и в полученном векторе клонировали целевые гены. Направленность генов определяли при помощи ПЦР с прай-мерами, подобранными к системе XVE и к нук-леотидной последовательности гена ARGOS-LIKE (таблица).
Получение трансгенных растений табака, морфологическая характеристика и условия выращивания растений. Трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana линии SR1 получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков, высеченных из листьев трехмесячных растений [6]. Растения трансгенных линий и контрольные растения культивировали в вегетационных сосудах объемом 45G мл, заполненных универсальным грунтом (Terra vita, Россия), в условиях теплицы при температуре 26°С с освещенностью около 14G ммоль/м2/с и фотопериодом 16/8 ч (свет/темнота). В качестве контрольных использовали нетрансгенные растения табака сорта Petit Havana линии SR1, выращенные на среде МС без добавления антибиотиков и акклиматизированные к условиям почвы. Также для контроля использовали трансгенные р
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.