ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2014, том 457, № 5, с. 618-621
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 612.017:612.018
РОЛЬ ГОРМОНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ГЕСТАЦИЕЙ, В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛ, ОТВЕЧАЮЩИХ ЗА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ NK-КЛЕТОК
© 2014 г. С. В. Ширшев, И. В. Некрасова, С. А. Заморина, О. Л. Горбунова,
Е. Г. Орлова, И. Л. Масленникова
Представлено академиком В.А. Черешневым 24.01.2014 г. Поступило 24.03.2014 г.
БО1: 10.7868/80869565214230315
Феномен толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду является актуальной проблемой репродуктивной иммунологии, в рамках которой важнейшим направлением является анализ роли гормонов в регуляции иммунитета. Известно, что в период ранней беременности натуральные киллеры (МК-клетки) являются преобладающей популяцией среди лимфоидных клеток, локализованных в децидуальной оболочке
[1]. МК-клетки с фенотипом СВ16+СВ56Шт составляют более 90% периферических МК-клеток и проявляют высокую цитотоксичность по сравнению с СВ16-СЭ56Ьг18Ь1 [2]. Предполагается, что децидуальные МК-клетки созревают из периферических СВ16-СЭ56Ьг18Ь1-лимфоцитов, мигрирующих в матку [3].
При беременности цитотоксический потенциал МК-клеточной популяции снижается за счет уменьшения процента лимфоцитов СВ16+СВ56й1т. В то же время повышенное содержание МК-клеток СЭ16+56Й1т в периферической крови у женщин ассоциировано с привычным невынашиванием беременности [4], что связано с их способностью лизировать клетки трофобласта [2]. В свою очередь, МК-клетки СВ16-СЭ56Ьг18Ь1 экспрессируют ингибиторные рецепторы, такие как МКС2Л и ЫЬЯБ, благодаря чему они реализуют иммуно-трофическую функцию вместо цитолитической
[2]. Так, маточные МК-клетки СВ16-СВ56Ьг1®м принимают непосредственное участие в имплантации, неоангиогенезе и поддержании беременности [3]. Кроме того, МК-клетки потенцируют индукцию Т-регуляторных лимфоцитов, что приводит к формированию иммунологической толерантности в период беременности [5].
Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук, Пермь
За цитотоксическую функцию NK-клеток наряду с молекулой CD16 отвечают активационные рецепторы NKG2D и NKp46, причем последний конститутивно экспрессируется на всей популяции NK-клеток и служит основным маркёром для их идентификации [6].
Известно, что гормоны могут детерминировать функциональную активность клеток иммунной системы [7]. Наиболее физиологически значимыми с этой точки зрения являются гормоны, появляющиеся в организме женщины только во время беременности, — хорионический гонадо-тропин (ХГ) и эстриол (Е3). Помимо этого имму-норегуляторную функцию осуществляют гормоны, уровень которых существенно повышается во время беременности за счет плацентарного синтеза. Речь, прежде всего, идет о лептине, грелине и кисспептине. Их важная роль в регуляции репродукции хорошо известна [8—10], однако модулирующая активность в отношении NK-клеток в концентрациях, наблюдаемых при физиологически протекающей беременности, практически не изучена.
Цель работы — оценка влияния ХГ, Е3, лепти-на, грелина и кисспептина на экспрессию молекул, отвечающих за функциональную активность NK-клеток.
Установлено, что в концентрациях, соответствующих I триместру беременности, ХГ, Е3 и кисспептин повышают количество CD56bnght-клеток. Одновременно Е3 и кисспептин, но не ХГ, снижают процент CD56dlm-лимфоцитов. Дополнительно кисспептин снижает количество NK-клеток, экспрессирующих как активационные (NKG2D), так и ингибиторные (LILRB) молекулы, а ХГ повышает уровень клеток, экспрессиру-ющих только ингибиторную молекулу NKG2A. В концентрациях, соответствующих III триместру беременности, ХГ, Е3, кисспептин, лептин и
Таблица 1. Концентрации гормонов в периферической крови по триместрам беременности
Гормоны Концентрация гормонов Источник
I триместр II—III триместр литературы
Лептин ("Sigma", США) 10 нг/мл 35 нг/мл [8]
Грелин ("Sigma", Израиль) 1.25* нг/мл 0.83# нг/мл [9]
Кисспептин ("Calbiochem", США) 4.6* пМ/л 9.6# пМ/л [10]
ХГ ("Profasi", Италия) 100 МЕ/мл 10 МЕ/мл [11]
Е3 ("ICN Biomedicals Inc.", Германия) 2 нг/мл 20 нг/мл [12]
Примечание. * — концентрация грелина и киссептина в периферической крови, характерная для I—II триместра беременности, # — концентрация грелина и киссептина в периферической крови, характерная для III триместра беременности.
грелин также повышают количество CD56bnght-клеток, снижая уровень CD56dim-лимфоцитов. Одновременно Е3 и лептин снижают экспрессию активационной молекулы NKG2D, а Е3 и кис-спептин повышают количество NK-клеток, несущих на мембране ингибиторную молекулу NKG2A. Кроме того, грелин и лептин способны в этот период беременности снижать уровень NK-клеток, несущих на своей поверхности ингиби-торную молекулу LILRB.
В работе использовали мононуклеары периферической крови женщин репродуктивного возраста (n = 7), выделенные в градиенте плотности фиколл-верографина (1.077 г/мл). Гормоны (ХГ, Е3, лептин, грелин и кисспептин) использовали в физиологических концентрациях, соответствующих I и II—III триместрам беременности (табл. 1).
Клетки культивировали в полной питательной среде (среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в присутствии гормонов репродукции в течение 3 сут, после чего оценивали их фенотип в лимфоцитарном гейте методом проточной цитометрии. Окрашивание клеток осуществляли согласно методике производителя мо-ноклональных антител ("eBioscience", США; "Beckman Coulter", США). При учете результатов подсчитывали не менее 100000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоци-тарного окна использовали соответствующие изотипические контроли.
NK-клетки идентифицировали по экспрессии молекулы NKp46 (Anti-human CD335-PC5, "Beck-man Coulter", США), присутствующей только на данном типе клеток [6]. Для оценки функциональной активности NK-клеток определяли экспрессию активационной молекулы NKG2D (Anti-human CD314-FITC, "eBioscience", США) и инги-биторных молекул — LILRB1 (Anti-human CD85j-PE, "Beckman Coulter", США) и NKG2А (Antihuman CD159-PE, "Beckman Coulter", США).
Также производили оценку степени экспрессии маркера CD56 (Anti-human CD56-PE, "Beckman Coulter", США) на N^46+-^™^
Статистическую обработку данных проводили с помощью парного критерия t Стьюдента.
При исследовании способности гормонов регулировать степень экспрессии молекул CD56 установлено, что ХГ, Е3 и кисспептин достоверно увеличивают процент клеток NKp46+CD56bnght, одновременно снижая уровень NKp46+CD56dim-лимфоцитов. Данный эффект, за исключением ХГ (100МЕ/мл), наблюдается вне зависимости от концентраций гормонов, экстраполированных с I—III триместров физиологически протекающей беременности, а стимулирующее действие кис-спептина тем сильнее, чем больше его концентрация. Лептин и грелин достоверно повышают процент CD56bпght-NK-клеток только в концентрациях, наблюдаемых в III триместре беременности. При этом лептин, в отличие от грелина, не снижает уровень CD56dlm-NK-лим-фоцитов (табл. 2). Таким образом, все исследуемые гормоны в большей или меньшей степени являются физиологическими индукторами высокой экспрессии молекулы CD56, обусловливая снижение цитолитического потенциала NK-кле-ток на протяжении всего периода беременности.
Оценка действия гормонов на экспрессию ин-гибиторных (NKG2A, LILRB) и активационной (NKG2D) молекул показала, что все без исключения исследуемые гормоны в той или иной степени способны регулировать этот процесс. Так, ХГ в концентрации, характерной для I триместра беременности, достоверно увеличивает процент NKp46+NKG2A+-клеток. Аналогичным эффектом обладает кисспептин, но в концентрации, экстраполированной с III триместра беременности. Таким образом, передается своеобразная эстафета от ХГ к кисспептину по поддержанию высокого уровня NK-клеток, экспрессирующих высокоаффинный ингибиторный рецептор. Е3, в отличие от ХГ и кисспептина, не только повышает уровень NKp46+NKG2A+-клеток, но и одно-
620 ШИРШЕВ и др.
Таблица 2. Влияние ХГ, Е3, лептина, грелина и кисспептина на степень экспрессии молекулы CD56 на NK-клет-ках (М ± m)
Триместр Экспериментальное воздействие NKp46+CD56bright (n = 7) NKp46+CD56dim (n = 7)
Контроль 1.67 ± 0.524 98.84 ± 0.348
I ХГ (100 МЕ/мл) 3.05 ± 0.694* 97.21 ± 0.845
III ХГ (10 МЕ/мл) 3.50 ± 0.777* 95.94 ± 1.316*
I Е3 (2 нг/мл) 3.38 ± 0.828* 95.66 ± 1.154*
III Е3 (20 нг/мл) 3.38 ± 0.707* 93.74 ± 2.287*
I Лептин (10 нг/мл) 2.06 ± 0.981 97.70 ± 1.972
III Лептин (35 нг/мл) 3.05 ± 0.739* 96.04 ± 1.520
I Грелин (1.2 нг/мл) 3.45 ± 0.986 96.83 ± 0.495
III Грелин (0.8 нг/мл) 3.38 ± 1.089* 95.01 ± 1.794*
I Кисспептин (4.6 пМ/л) 2.53 ± 0.460* 96.64 ± 0.771*
III Кисспептин (9.6 пМ/л) 3.22 ± 0.674*# 95.61 ± 0.804*
Примечание. Здесь и в табл. 3 * — достоверные (р < 0.05) различия с контролем; # — достоверные (р < 0.05) различия с кисспеп-тином (4.6 пМ/л).
Таблица 3. Влияние ХГ, Е3, лептина, грелина и кисспептина на экспрессию активационных и ингибиторных молекул интактными NK-клетками (М ± m)
Триместр Экспериментальное воздействие NKp46+NKG2D+ (n = 7) NKp46+NKG2A+ (n = 7) NKp46+LILRB+ (n = 7)
Контроль 0.88 ± 0.096 5.01 ± 0.558 4.04 ± 0.685
I ХГ (100 МЕ/мл) 1.33 ± 0.291 7.06 ± 0.885* 3.90 ± 1.297
III ХГ (10 МЕ/мл) 0.93 ± 0.230 5.17 ± 0.616 3.35 ± 0.711
I Е3 (2 нг/мл) 0.91 ± 0.247 5.68 ± 0.645 3.34 ± 0.972
III Е3 (20 нг/мл) 0.67 ± 0.118* 6.28 ± 0.624* 3.23 ± 0.747
I Лептин (10 нг/мл) 0.73 ± 0.090 4.11 ± 0.781 4.05 ± 0.781
III Лептин (35 нг/мл) 0.55 ± 0.093* 4.77 ± 0.761 2.93 ± 0.458*
I Грелин (1.2 нг/мл) 0.89 ± 0.085 4.86 ± 0.099 4.87 ± 0.832
III Грелин (0.8 нг/мл) 0.82 ± 0.143 5.36 ± 0.947 2.28 ± 0.534*
I Кисспептин (4.6 пМ/л) 0.66 ± 0.095* 4.60 ± 0.840 2.70 ± 0.428*
III Кисспептин (9.6 пМ/л) 0.82 ± 0.133 6.44 ± 0.759* 4.21 ± 1.126
временно снижает процент NK-клеток, экспрес-сирующих активационный рецептор этого же семейства — NKG2D. Данный эффект реализуется только в III триместре беременности и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.