ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2011, том 58, № 6, с. 817-825
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
РОЛЬ ХЛОРОФИЛЛОВ И КАРОТИНОИДОВ В УСТОЙЧИВОСТИ СЕМЯН
К АБИОТИЧЕСКИМ СТРЕССОРАМ © 2011 г. Г. Н. Смоликова*, Н. А. Ламан**, О. В. Борискевич**
*Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра физиологии и биохимии растений, лаборатория
биологии развития растений, Санкт-Петербург **Институт экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича Национальной академии наук Беларуси, лаборатория роста и развития растений, Минск, Беларусь Поступила в редакцию 08.03.2011 г.
Установлено, что при созревании семян высших растений хлорофиллы разрушаются не полностью и их можно обнаружить в физиологически зрелых семенах. Повышенное содержание остаточных хлорофиллов семян снижает их устойчивость к абиотическим стрессорам. Каротиноиды в семенах представлены преимущественно лютеином и, в значительно меньших количествах, в-каротином. Показано, что каротиноиды накапливаются в семенах при ускоренном старении и под действием высоких температур при прорастании. Для оценки устойчивости семян к стрессовым воздействиям предлагается использовать отношение каротиноидов к хлорофиллам (Кар/Хл). Семена с более высоким отношением Кар/Хл характеризуются повышенной устойчивостью к стрессовым воздействиям. Предполагается, что присутствующие в семенах хлорофиллы усиливают окислительный стресс, который индуцируется под действием абиотических стрессоров. В роли антиоксидантов, защищающих семена от окислительного стресса, рассматриваются каротиноиды.
Ключевые слова: покрытосеменные растения — семена — хлорофиллы — каротиноиды — ксантофиллы — лютеин — ускоренное старение — прорастание — тепловой стресс
ВВЕДЕНИЕ
Независимо от того, в каких условиях хранятся семена — оптимальных или неблагоприятных, с течением времени они постепенно стареют, снижается их качество и, в конечном счете, теряется жизнеспособность [1]. Чем ниже влажность и температура окружающей среды, тем медленнее накапливаются повреждения в семенах и тем дольше они способны храниться [2]. С другой стороны, при повышении влажности и температуры повреждения накапливаются и ускоряется старение семян. На этом эффекте основан метод ускоренного старения, который заключается в том, что семена выдерживают в течение нескольких суток при повышенных температуре и влажности воздуха [3]. Семена, которые лучше переносят неблагоприятные условия ускоренного старения, более устойчивы к абиотическим стрессорам при прорастании.
Сокращения: Хл — хлорофиллы; отношение Кар/Хл — содержание каротиноидов по отношению к хлорофиллам; ИФХ — интенсивность флуоресценции хлорофиллов; УС — ускоренное старение семян.
Адрес для корреспонденции: Смоликова Галина Николаевна. 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9. Кафедра физиологии и биохимии растений, биолого-почвенный факультет, Санкт-Петербургский государственный университет. Электронная почта: galina.smolikova@gmail.com
В основе повреждений, приводящих к старению семян и снижению их стресс-устойчивости, лежит генерация свободных радикалов, которую инициирует автоокисление липидов, и неферментативное гликозилирование [1—4]. Эти реакции не требуют высокого влагосодержания и их продукты способны накапливаться в воздушно -сухих семенах, что приводит к окислительным повреждениям мембран, белков и ДНК. Одним из важных факторов генерации активных форм кислорода (АФК), ускоряющих старение, могут быть присутствующие в семенах хлорофиллы (Хл).
Наличие в семенах Хл было описано еще в 1909 г. Монтеверде и Любименко [5]. Более подробно этот феномен был описан в 1973 г. в монографии Яковлева и Жуковой "Покрытосеменные растения с зеленым и бесцветным зародышем (хлоро-и лейкоэмбриофиты)" [6]. Основываясь на собственных данных и литературных источниках, авторы проанализировали содержание Хл в зародышах зрелых семян 1094 видов из 182 семейств покрытосеменных растений и сделали вывод о том, что пигмент присутствует у 428 видов из 72 семейств. Несмотря на то, что факт присутствия Хл известен давно, вопрос о биологической сущности этого явления до сих пор остается открытым.
Известно, что в защите семян от АФК принимают участие токоферолы, аскорбат и глутатион [7]. Не исключено также, что эти функции могут выполнять и каротиноиды, которые играют важную роль в предотвращении фотоокислительного повреждения листьев [8, 9] и созревающих плодов [1G].
Целью данной работы являлось исследование роли Хл и каротиноидов в устойчивости семян к абиотическим стрессорам. Для этого анализировали динамику содержания фотосинтетических пигментов в семенах растений при созревании, ускоренном старении и под действием теплового стресса при прорастании.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали семена капусты белокочанной (Brassica oleracea L. var. capitata L.), рапса (Brassica napus L. var. napus), моркови (Daucus carota L.), люпина (Lupinusangustifolius L.), кукурузы (Zea mays L.), сои культурной (Glycine max L.), яровой вики (Vicia sativa L.) и козлятника восточного (Galega orientalis Lam.).
Сортировка семян по содержанию хлорофиллов. Семена капусты белокочанной сорта Бартоло сортировали по интенсивности флуоресценции хлорофиллов (ИФХ) в семенных оболочках по методу [11] на установке SeedScan I Laser Sorter ("Sataka", США). Семена размещали на вращающемся диске с углублениями, облучали светом длиной волны 65G нм и регистрировали флуоресценцию хлорофиллов при 73G нм. Полученное значение флуоресценции использовали для разделения семян на фракции с высокой и низкой интенсивности флуоресценции хлорофиллов (ИФХ). Семена ярового рапса с. Антей сортировали визуально по цвету семенной оболочки на черные, коричневые и зеленовато-коричневые.
Ускоренное старение. Семена капусты выдерживали 7 суток при 220С в эксикаторе с 86% равновесной влажностью воздуха (РВВ), затем запаковывали в пакеты с алюминиевой основой и помещали на 6 суток в термостат при 4G0Q
Температурный стресс. Семена капусты набухали 12 ч при 220С на увлажненной фильтровальной бумаге. Набухшие семена инкубировали 4 или 8 ч при 5G0Q Контролем служили семена, инкубированные при 220С.
Оценка развития проростков. Семена проращивали при 220С в течение 1G суток. На Ю-е сутки прорастания оценивали количество нормально развитых проростков, ненормально развитых проростков и непроросших семян.
Определение содержания Хл a и b, каротинов и ксантофиллов в семенах спектрофотометрическим методом. Методика определения пигментов в семенах подробно описана нами в работе [12]. Растительную ткань массой 5GG мг растирали в 2 мл
смеси петролейного эфира и тетрагидрофурана (4 : 1). Гомогенат фильтровали через капроновую мембрану с диаметром пор 0.45 мкм. Спектры поглощения полученных фильтратов регистрировали на спектрофотометре Unikon 931 ("Kontron Instrument", Германия). Для расчета содержания пигментов использовали формулы, приведенные в работе [12].
Определение состава каротиноидов методом ВЭЖХ. Экстракцию пигментов проводили в смеси метанол : этилацетат : ацетонитрил (1 : 2 : 2). Для анализа использовали жидкостной хроматограф Цвет-4000 (Россия). Пробу детектировали спектрофотометрически при 470 нм. Хроматогра-фическая колонка — внутренний диаметр 4.2 мм, длина 15 см, заполненная сепароном C-18 c диаметром частиц силикагеля 7 мкм. Предколонка — внутренний диаметр 4.2 мм, длина 4 см, заполненная тем же сорбентом. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила : этилацета-та : метанола : воды (85 : 7 : 7 : 1). Скорость подвижной фазы составляла 500 мкл/мин. Калибровку прибора осуществляли с использованием стандартных препаратов лютеина, зеаксан-тина, ликопина и р-каротина фирмы "Fluka" (Швейцария).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ содержания пигментов в физиологически зрелых семенах ряда видов и сортов сельскохозяйственных растений показал, что во всех исследованных образцах присутствуют остаточные Хл (a + b) (рис. 1а). Наиболее высокое их количество регистрировали в семенах моркови (20—52 мкг/г абсолютно сухого вещества), далее следовали вика (10—12 мкг/г), галега (5 мкг/г), рапс (3.5 мкг/г), люпин (0.7—1.1 мкг/г), кукуруза (0.5—0.6 мкг/г) и соя (0.3—0.4 мкг/г). Соотношение Хл a к Хл b не было постоянным и варьировало от 0.5 у кукурузы до 2.4 у рапса. Наиболее высокое содержание каротиноидов было характерно для семян рапса (12— 17 мкг/г абсолютно сухого вещества) и моркови (12 мкг/г), наиболее низкое — для семян сои (1 мкг/г), в остальных образцах их уровень находился в пределах 4—7 мкг/г (рис. 1б).
Если рассчитать отношение каротиноидов к хло-рофиллам (Кар/Хл), то можно видеть (рис. 1в), что оно находится в обратно пропорциональной зависимости от суммарного содержания Хл (a + b) и варьирует от 0.1 в семенах моркови до 9.5 в семенах люпина (рис. 1в). Анализ состава каротиноидов спектрометрическим методом позволил установить, что в семенах присутствовали как ксантофиллы, так и каротины (рис. 1б). Согласно данным ВЭЖХ, в состав экстрактов, выделенных из семян рапса и капусты, входили лютеин, Хл a и p-каротин (рис. 2а и б), а в экстрактах сои присутствовал только лютеин (рис. 2в). Спектр погло-
(а)
н и Грей
п ю Л Першацвет
руза Немо
Алеся
с п Неман
а Р Антей
я Ясельда
о С Припять
1 Нестерка
а Горноалтайский
ка Натали
и В Глинковская элита
ь в о Тушон
к р о Шантэнерояль
I
(б)
(в)
^ ^ ^ ^
0 10 20 30 40 50
Содержание, мкг/г абсолютно сухого вещества
Рис 1. Содержание хлорофиллов (а), каротиноидов (б) и отношение каротиноидов к хлорофиллам (в) в экстрактах, выделенных из зрелых семян разных видов и сортов культурных растений (спектрофотометрический метод). На (а): □ — Хл Ь, ■ — Хл а; на (б): □ — каротины, ■ — ксантофиллы.
мВ
5.5
5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5
16
(а)
33
50
4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
0
(б)
2
16 33 50 66 Время выхода, мин
2.0
1.5
1.0
3
0.5
у"
(в)
J_1_
83 0 16 33 50 66
Рис. 2. Разделение пигментов, содержащихся в экстрактах семян рапса (а), капусты (б) и сои (в) методом ВЭЖХ. 1 — лютеин; 2 — Хл а; 3 — Р-каротин.
1
1
3
Длина волны,нм
Рис. 3. Спектры поглощения лютеина (Лт), Хл a и эк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.