РОЛЬ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА И ЕГО ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ В РЕГУЛЯЦИИ ФАКТОРОВ ИММУННОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ
Заморина С. А.1, Лопатина В. А.1, Рябова Ж. В.2
'ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН; 2Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия
Изучали роль хорионического гонадотропина (ХГ) и его пептидных фрагментов (LQGV, AQGV, LAGV) в регуляции основных факторов иммунологической толерантности - продукцию IL-10 субпопуляцией Treg и продукцию IL-17A субпопуляцией Th17, а также активность индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO). Показано, что ХГ и его пептидные фрагменты стимулируют продукцию IL-10, одновременно угнетая продукцию IL-17A. ХГ и LQGV, AQGV, LAGV также повышали активность LPS-индуцированной IDO. Таким образом, продемонстрированы ранее неизвестные иммуномодулирующие эффекты пептидных фрагментов ХГ, что открывает возможность их использования в качестве терапевтических средств.
Ключевые слова: хорионический гонадотропин, регуляторные олигопептиды (LQGV, AQGV, VLPALP), IL-10, IL-17, IDO)
Известно, что фрагменты функциональных белков формируют «пептидом», как логическое продолжение «протеома», и способны оказывать эффекты, аналогичные действию целой молекулы [1]. Хорионический гонадотропин (ХГ) является ключевым гормоном с позиций сохранения и нормального развития беременности и обладает выраженным иммуномодулиру-ющим действием [2, 3]. Пептидные фрагменты ХГ, в частности, олигопептиды ^-субъединицы ХГ (LQGV, AQGV, VLPALP и прочие), успешно работают в моделях in vivo, демонстрируя им-муномодулирующие и противовоспалительные эффекты [4]. Ряд композиций из олигопеп-тидов, входящих в состав первичной структуры в-субъединицы ХГ, запатентованы как терапевтические средства [5]. Например, олигопептид AQGV проходит клинические испытания под рабочим названием ЕА-230 как противовоспалительное средство [6].
Однако, иммуномодулирующие эффекты этих олигопептидов в отношении недавно открытых субпопуляций Т-регуляторных (Treg) и IL-17A-продуцирующих лимфоцитов (Th17) только начинают изучаться. Эффекты фрагментов ХГ в модуляции активности индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) ранее не изучались, однако известно, что самостоятельный эффект ХГ заключается в повышении
активности этого фермента [2]. Активация IDO может приводить к гибели цитотокси-ческих лимфоцитов вследствие дефицита необходимой для их активности аминокислоты и выделения токсичных продуктов ее деградации, таких как кинуренин. Для супрессии иммунного ответа Treg клетки также выделяют IL-10, дистантно ингибирующий иммунный ответ [7]. IL-17A, являясь продуктом Th17, относится к провоспалительным цитокинам и играет важную роль в индукции воспаления, развитии аутоиммунных заболеваний и остром отторжении трансплантата [7].
Целью работы являлась оценка роли ХГ и его фрагментов (LQGV, AQGV, VLPALP) в регуляции продукции IL-10 субпопуляцией Treg и продукции IL-17A субпопуляцией Th17, а также оценка активности IDO в моноцитах в системе in vitro.
Материал и методы. Исследовали периферическую кровь небеременных женщин репродуктивного возраста, находящихся в фолликулярной фазе менструального цикла. Суспензию мононуклеаров получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3). Далее, методом иммуномагнитной сепарации («Invitrogen», США), из суспензии мононуклеаров выделяли CD4+-лимфоциты, которые инкубировали в плоскодонном 96-лу-
320
Иммунорегуляция
ночном планшете (105кл/мл - 5 106/мл) в полной питательной среде (ППС: RPMI-1640 с добавлением 10% ЭТС («Sigma», США), 10 мМ Hepes («ICN Ph.», США), 2 мМ L-глутамина («ICN Ph.», США) и 100 мкг/мл гентамицина («KRKA», Словения) в течение 72 ч при 37°С в условиях 5% СО2 с гормоном и олигопепти-дами. В контрольные пробы вместо гормона добавляли равный объем ППС. ХГ («Profasi», Италия) применяли в концентрациях 10 МЕ/мл (2 мкг/мл) и 100 МЕ/мл (20 мкг/мл), отражающих уровень гормона во II-III и I триместры беременности, соответственно [8]. Синтетические олигопептиды (LQGV, AQGV, LAGV («Научно-исследовательская лаборатория АТГ Сервис ген», Россия) применяли в терапевтических концентрациях 1 мкг/мл и 20 мкг/мл [4].
Продукцию IL-10 оценивали иммунофер-ментным методом («Вектор-Бест», Россия) в 3-х сут. культуре СБ4+-позитивных лимфоцитов, примированных в фенотип Treg трансформирующим фактором роста ß (TGF-ß, 5 нг/мл, «GIBCO», США). В культуры вносили также магнитные частицы (anti-CD3/ CD28 «Invitrogen», США), и нейтрализующие анти-IFN-y и анти-^-4 антитела (10 мкг/мл, «eBioscience», США). Продукцию IL-17A оценивали по аналогичной схеме, в культуре CD4+-позитивных лимфоцитов, примированных в фенотип Th17 цитокинами IL-1ß и IL-6 (по 10 нг/мл, «eBioscience»). Полученные данные интерпретировались как продукция IL-10 субпопуляцией Treg и продукция IL-17A субпопуляцией Th17, поскольку доминини-рующий Th1/Th2 путь дифференцировки был
нейтрализован анти-IFN-y и анти-^-4 антителами.
Активность индоламин-2,3-диоксидазы (IDO) моноцитов определяли спектрофотоме-трически по изменению концентрации кинуре-нина, как в спонтанном, так и стимулированном липополисахаридом (LPS, 100 нг/мл) («Sigma», США) варианте теста [9]. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием парного t-критерия Стьюдента.
Результаты. Известно, что Treg секрети-руют IL-10, который является противовоспалительным цитокином и подавляет про-лиферативный ответ Т-клеток на антигены и митогены, продукцию всех провоспалитель-ных цитокинов, а также секрецию активированными моноцитами IL-1^, TNF-a и IL-6 [7]. Установлено, что ХГ, независимо от используемой концентрации, повышает продукцию IL-10 в культуре CD4+-лимфоцитов, примированных в фенотип Treg (табл.). Фрагменты ХГ оказывали аналогичные по направленности эффекты. Так, в низкой дозе (1 мкг/мл) продукцию IL-10 стимулировал только AQGV, однако в высокой дозе (20 мкг/мл) стимулирующий эффект оказывали все исследуемые олигопептиды, демонстрируя дозовую зависимость (табл.). Таким образом, олигопептид AQGV наиболее эффективен с позиции регуляции продукции IL-10. Известно, что эктопическая беременность, а также спонтанные аборты сопровождаются достоверным снижением, уровней мРНК IL-10, а также мРНК ХГ в сравнении с нормальной беременностью [3]. Таким образом, как ХГ, так и его фрагменты
Таблица. Влияние ХГ и его фрагментов (олигопептиды в-субъединицы) на факторы иммунной толерантности
Экспериментальное воздействие IL-10, пг/мл IL-17A, пг/мл Активность IDO, (кинуренин, мкМ)
Спонт. Стим.LPS
Контроль 827,94±40,15 232,46±7,87 4,75±0,29 7,89±0,32
ХГ (2 мкг/мл) 1255,22±137,59* 166,77±11,12* 4,79±0,48 8,94±0,38
ХГ (20 мкг/мл) 1217,54±87,77* 187,64±7,41* 5,40±0,24 9,50±0,66*
LQGV (1 мкг/мл) 905,50±52,26 196,09±3,29* 4,36±0,35 9,52±0,87*
LQGV (20 мкг/мл) 1244,35±131,89*Л 155,59±17,25*Л 4,52±0,54 10,61±1,15*
AQGV (1 мкг/мл) 1139,42±83,63* 188,91±6,20* 5,98±0,39* 10,18±0,31*
AQGV (20 мкг/мл) 1322,22±71,73*Л 183,74±3,22* 6,24±0,52* 10,93±0,81*
VLPALP (1 мкг/мл) 889,42±31,57 165,63±13,18* 4,38±0,38 6,89±0,52
VLPALP (20 мкг/мл) 1222,22±70,71*Л 188,08±4,02* 5,08±0,50 7,41±0,55
Примечание: "достоверные по ^критерию Стьюдента (р<0,05) различия с контролем; лразличия между дозами олигопептидов.
являются важными факторами индукции Treg, супрессорная активность которых определяет, в конечном итоге, исход беременности.
Показано, что ХГ и его фрагменты угнетают продукцию IL-17A в культуре CD4+-лимфоцитов, примированных в фенотип Th17 (табл.). Важно отметить, что нормальная беременность сопровождается снижением Th17 в периферической крови, в то время как повышение уровня Th17 может вести к преждевременным родам или спонтанному аборту [7]. Таким образом, ХГ и его фрагменты участвуют в регуляции Th17, способствуя удачному исходу беременности.
Фермент IDO инициирует окислительную деградацию L-триптофана по кинурениновому пути. Клетки, экспрессирующие IDO, и продукты метаболита триптофана вовлекаются в индукцию иммунной толерантности [9]. Установлено, что ХГ не влияет на спонтанный уровень продукции кинуренина, однако в высокой концентрации стимулирует LPS-индуцированную активность IDO (табл.). Фрагменты ХГ (AQGV и LQGV, но не VLPALP) оказывали аналогичные эффекты на LPS-индуцированную активность IDO. Важно отметить, что олигопептид AQGV эффективен в отношении стимуляции IDO в спонтанном варианте теста (табл.).
Ранее нами было показано, что олигопеп-тиды, родственные в-субъединице ХГ (LQGV, AQGV, VLPALP) увеличивают уровень Treg (CD4+FOXP3+) и Treg, экспрессирующих CTLA-4 (CD4+FOXP3+CTLA4+). В отношении Th17 было установлено, что эти снижали экспрессию ROR-yt и IL-17A СD4+-лимфоцитами [10]. В целом, дополнительно нами установлено, что пептидные фрагменты ХГ, непосред-
ственно контролируют продукцию IL10 и IL-17A субпопуляциями Treg/Th17 и повышают активность IDO в моноцитах.
Таким образом, продемонстрированы ранее неизвестные эффекты олигопептидных фрагментов в-субъединицы ХГ, являющимися естественными продуктами катаболизма молекулы ХГ. Фундаментальная сторона исследования заключается в изучении механизмов контроля со стороны пептидома человека за изменением иммунной системы в период беременности, обеспечивающей толерантность матери к антигенам плода. Помимо этого, у исследования есть прикладной аспект, который заключается в возможности применения фрагментов ХГ в качестве терапевтических средствах для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний.
Работа поддержана грантом РФФИ 13-04-96024
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ivanov V. T., Yatskin O. N. Expert Rev. Proteomics 2005, 2, 463-473.
2. Заморина С. А., Ширшев С. В. Иммунология 2013. 34, 2. С.105-107.
3. Shumacher A., Heinze K., Witte J. et al. J. Immunol. 2013,190,2650-2658.
4. Van der Zee M, Van den Berg J. W., Van Holten-Neelen C., Dik W. A. J. Immunol. 2010, 185, 9, 5066-73.
5. Khan N. A., Benner R., EPC 1 887016 B1, 2008.
6. Khan N. A., Benner R. Endocr. Metab. Immune Disord. Drug Targets. 2011, 11, 1, 32-53.
7. Saito S., Nakashima A., Shima T., Ito M. Am. J. Reprod. Immun
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.