БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 1-2, с. 114-122
УДК 612.82
РОЛЬ КАЛЬЦИЙ-ПРОНИЦАЕМЫХ АМРА РЕЦЕПТОРОВ В МЕХАНИЗМЕ ДИСИНАПТИЧЕСКОГО ТОРМОЖЕНИЯ В ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЕ КРЫСЫ © 2012 г. А. В. Зайцев, К. Х. Ким, Л. Г. Магазаник*
Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, пр. Тореза, д. 44, Санкт-Петербург, 194223, Россия; *электронная почта: levmagazanik100@gmail.com Поступила в редакцию 08.09.2011 г.
Кальций-проницаемые АМРА рецепторы (Са-АМРА) играют важную роль в синаптической передаче и проявлениях ее пластичности. При некоторых патологических состояниях они могут быть индукторами гибели нейронов. Непосредственное участие Са-АМРА рецепторов в патогенезе многих заболеваний ЦНС делает их привлекательной мишенью для избирательной фармакологической блокады с целью предупреждения и купирования патологических процессов. Однако для практического применения селективных блокаторов Са-АМРА рецепторов необходимо доскональное изучение механизма их участия в функционировании нейронных сетей в нормальных условиях. Целью работы стало изучение роли Са-АМРА рецепторов в регуляции порогов возбуждения у нейронов разного типа, а также участие Са-АМРА рецепторов в поддержании баланса возбуждения и торможения в коре. Для этого исследовали воздействие блокады Са-АМРА рецепторов на подпороговые постсинаптические ответы и генерацию потенциалов действия в ответ на внеклеточную стимуляцию интернейронов и пирамидных клеток. Потенциалы регистрировали в переживающих срезах префронтальной коры крысы методом фиксации тока на целой клетке. Фармакологическую блокаду Са-АМРА рецепторов проводили специфическим каналоблокатором ИЕМ-1460 (100 мкМ), ди-катионным производным адамантана. При пачечной, но не при одиночной стимуляции блокада Са-АМРА рецепторов снижала порог генерации потенциала действия в пирамидных клетках в результате подавления дисинаптического торможения в коре, вызванного частичной блокадой возбуждающих входов в ГАМКергические тормозные интернейроны. Таким образом, блокада Са-АМРА рецепторов смещала баланс возбуждения и торможения в коре в пользу возбуждения.
Ключевые слова: фронтальная кора, ГАМКергический интернейрон, пирамидный нейрон, диси-наптическое торможение, кальций-проницаемые АМРА рецепторы.
Глутамат является основным возбуждающим нейромедиатором в ЦНС млекопитающих. Выделяют три основных типа глутаматных рецепторов: АМРА, ММЭА и каинатные рецепторы. Среди них АМРА рецепторы в наибольшей степени ответственны за быструю передачу возбуждения между нейронами. АМРА рецептор представляет собой комплекс из четырех одинаковых или двух пар разных субъединиц (С1иА1-4) [1]. Биофизические свойства рецептора существенно зависят от наличия в его составе субъединицы С1иА2. Так, АМРА рецепторы, не содержащие в своем составе субъединиц С1иА2, в отличие от остальных вариантов АМРА рецепторов, проницаемы для ионов Са2+, имеют более высокую ионную проводимость, а также блокируются эндогенными полиаминами при положительных значениях мембранного потенциала, что приводит к выпрямлению вольт-амперной характеристики [2]. Такие кальций-проницаемые АМРА (Са-АМРА) рецепторы широко распространены в нейронах млеко-
питающих на самых ранних этапах онтогенеза, тогда как у взрослых животных их обнаруживают преимущественно в популяциях бесшипиковых нейронов [3], например, в ГАМКергических интернейронах коры, гигантских холинергических нейронах стриатума и др. [4—6]. Физиологическое значение такого неравномерного представительства Са-АМРА рецепторов является предметом исследований.
Обнаружено, что уровень экспрессии Са-АМРА рецепторов нейронами взрослых животных может меняться в зависимости от активности и функционального состояния синапсов. Так, блокада си-наптической активности в культуре или переживающих срезах мозга с помощью тетродотоксина, высокой концентрации ионов К+, блокаторов АМРА или ММПА рецепторов приводит к повышению экспрессии Са-АМРА рецепторов [3, 7—9], и, наоборот, высокочастотная стимуляция снижает представительство Са-АМРА рецепторов в
синапсах звездчатых клеток мозжечка [10, 11]. Известно, что при развитии долговременной по-тенциации в постсинаптическую мембрану первоначально встраиваются Са-АМРА рецепторы, которые в дальнейшем заменяются на АМРА рецепторы, имеющие в своем составе С1иА2-субъ-единицы [12]. Процессы забывания также требуют специфического участия Са-АМРА рецепторов [13]. Таким образом, Са-АМРА рецепторы представляют собой очень динамичный пул рецепторов, вовлеченный во множество нормально протекающих физиологических процессов.
Кроме этого, экспрессия Са-АМРА рецепторов в нервных клетках существенно возрастает при различных патологических состояниях, таких как ишемический инсульт, эпилепсия, различные травматические повреждения мозга, болезнь Альцгеймера, глиобластома и пр., что повышает вход ионов Са2+ в клетку при воздействии глутамата и может привести к клеточной гибели [14, 15]. Непосредственное участие Са-АМРА рецепторов в патогенезе многих заболеваний ЦНС делает их привлекательной мишенью для избирательной фармакологической блокады с целью предупреждения и купирования патологических процессов. В то же время, блокада Са-АМРА рецепторов может повлечь различные нежелательные эффекты, учитывая их широкую вовлеченность в нормальное функционирование нервной системы.
В настоящее время показано, что высокой селективностью по отношению к Са-АМРА рецепторам обладает ряд природных и синтезированных полиаминных каналоблокаторов, среди которых наиболее известны филантотоксин, аргиотоксин-636, JSTX-3, А§екохт-489, ИЭМ-1460 и др. [16—20]. При изучении действия производных фенилциклогексила и адамантана на глу-таматные рецепторы изолированных нейронов мозга крысы была детально исследована связь между их химическим строением и способностью блокировать открытое состояние Са-АМРА рецепторов. В частности, было обнаружено, что избирательной блокирующей способностью по отношению к Са-АМРА рецепторам обладают дика-тионные соединения [21], при этом максимальную активность проявляли соединения с расстоянием между атомами азота в пять метиленовых групп [22]. Была исследована также способность целого ряда разработанных нами новых каналоблокато-ров Са-АМРА и/или ММЭА рецепторов предупреждать экспериментально вызванные судорожные и каталептические состояния у крыс и мышей [23—27]. При этом обнаружилось, что эффективность терапии таких состояний избирательными Са-АМРА блокаторами в целом ниже, чем при применении ММЭА блокаторов. Более того, при некоторых условиях Са-АМРА блокато-
ры даже способствовали проявлению патологических симптомов [23].
С целью анализа физиологической роли Ca-АМРА рецепторов мы применили один из избирательных блокаторов этих каналов, дикатионное производное адамантана, ИЭМ-1460. Исследовали его влияние на пороги возбуждения потенциалов действия (ПД) пирамидных клеток коры в переживающих срезах мозга крысы. В результате обнаружили, что блокада глутаматергической передачи через Ca-АМРА рецепторы приводит к парадоксальному снижению порогов генерации ПД в пирамидных клетках, однонаправленному с действием бикукуллина, антагониста тормозной ГАМКергической системы. Дополнительно проведенные эксперименты показали, что этот эффект обусловлен подавлением дисинаптического торможения в коре, вызванным частичной блокадой возбуждающих входов к интернейронам. Таким образом, блокада Ca-АМРА рецепторов ведет к смещению баланса возбуждения и торможения в коре в сторону возбуждения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Крыс линии Вистар (14—18 дней) декапитиро-вали после цервикальной дислокации. Мозг быстро извлекали и помещали в охлажденную (0°С) искусственную спинномозговую жидкость (ИСМЖ) следующего состава (в мМ): 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 Na2HPO4, 25 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 12 глюкозы; pH 7.3—7.4; раствор аэрировали газовой смесью 95% O2/5% CO2. Коронарные срезы коры толщиной 300 мкм были сделаны на вибротоме (Vibroslice 752M, Campden Instruments). Срезы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре до начала электрофизиологического эксперимента.
Для регистрации электрофизиологических свойств нейронов срез помещали в перфузируе-мую камеру под микроскопом Axioscop 1 (Carl Zeiss, Германия). Визуализацию нейронов обеспечивали с помощью оптики Номарского (диф-ференционно-интерференционного контраста, DIC). Изображение передавали на видеокамеру (Sanyo VCB-3512P, Япония) и демонстрировали на мониторе, что позволяло хорошо различать форму нейронов и производить их первоначальную идентификацию. Пирамидные нейроны определяли по характерной треугольной форме тела и выраженному апикальному отростку, интернейроны — по овальной или округлой форме тела небольшого размера без апикального отростка.
Электроды с входным сопротивлением 3—5 МОм изготавливали из боросиликатного стекла, заполняли внутриклеточным раствором следующего состава (в мМ): 114 глюконата калия, 6 KCl, 10 HEPES, 0.2 EGTA, 4 Mg-ATP, 0.3 GTP, pH 7.25.
5 мВ
Рис. 1. Методика проведения эксперимента. a — Схема расположения электродов. Монополярный стеклянный электрод устанавливали на границе 6-го слоя и белого вещества, чтобы избежать прямой активации аксонов ГАМКергиче-ских интернейронов. Предположительно, при данном положении электрода происходит стимуляция таламокорти-кальных и кортико-кортикальных глутаматергических волокон, которые контактируют с пирамидными клетками (черная) и ГАМКергическими интернейронами (серый). Сигналы отводили от нейронов 2—3 слоев медиальной пре-фронтальной коры. Цифрами обозначены корковые слои. б — Типичные примеры записей ответов пирамидного нейрона (слева) и быстро разряжающегося интернейрона (справа). Клетки существенно отличаются по частоте ответов при силе стимуляции, равной двум реобазам (верхние записи). Пирамидные нейроны показывают большую частотную адаптацию, чем интернейроны. ПД интернейронов завершался быстрой высокоамплитудной однофазной следовой гиперполяризацией. У пирамидных нейронов следовая гиперполяризация была медленнее и меньше по амплитуде. в — Пример опреде
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.