научная статья по теме РОЛЬ КИССПЕПТИНА В ФОРМИРОВАНИИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ Математика

Текст научной статьи на тему «РОЛЬ КИССПЕПТИНА В ФОРМИРОВАНИИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2014, том 457, № 4, с. 494-497

КЛЕТОЧНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ

УДК 612.01.8:612.017.1:611.018.53

РОЛЬ КИССПЕПТИНА В ФОРМИРОВАНИИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ

© 2014 г. О. Л. Горбунова, С. В. Ширшев

Представлено академиком В.А. Черешневым 24.01.2014 г. Поступило 12.03.2014 г.

БО1: 10.7868/80869565214220289

С позиции иммунологии репродукции беременность представляет собой физиологически обусловленное состояние толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду [1]. Наиболее важными механизмами формирования толерантности являются увеличение адаптивных Т-регуляторных клеток (aTreg), угнетающих иммунный ответ; снижение интерлейкин 17 (1Ь-17)-Т-лимфоцитов-хелперов (Th17) [1, 2], стимулирующих цитотоксические реакции, и индукция фермента индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) антигенпрезентирующими клетками (APC), способствующего формированию локальной иммунной толерантности в децидуальной оболочке

[3].

Установление причин, приводящих к формированию иммунологической толерантности при беременности, важно не только для понимания механизмов сосуществования двух генетически чужеродных организмов, но и для представлений об индукции канцерогенеза. Гормоны являются важными модуляторами функциональной активности клеток иммунной системы. Особенно это актуально для гормонов, продуцируемых плацентой [4].

Недавно открытый гормон кисспептин, который регулирует функционирование гонадостата на гипоталамическом уровне [5], во время беременности продуцируется плацентой и, благодаря этому, появляется в системном кровообращении матери [4]. Его иммуномодулирующее действие только начинает изучаться [6], но уже установлено, что клетки иммунной системы экспрессиру-ют для него специфические мембранные рецепторы [7].

Цель работы — исследование роли кисспепти-на в регуляции формирования функционально активных аТ^ и Th17, а также экспрессии IDO моноцитами.

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук, Пермь

Показано, что кисспептин в концентрациях, характерных для I—III триместров беременности, усиливает формирование аТге§ лимфоцитов (CD4+FOXP3+CTLA-4+ GITR+) из TGF-рЬприми-рованных CD4+Т-лимфоцитов, повышая продукцию IL-10 CD4+T-лимфоцитами женщин. Одновременно кисспептин снижает уровень ТЫ7-кле-ток и секрецию IL-17A СD4+Т-лимфоцитами. В концентрации, соответствующей II триместру беременности, гормон достоверно усиливает ли-пополисахаридиндуцируемую активность IDO моноцитами. Таким образом, кисспептин является новым, ранее не учитываемым фактором формирования иммунологической толерантности во время физиологически протекающей беременности.

В работе использовали фракционированную суспензию мононуклеарных клеток периферической крови (МПК) шести здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (от 23 до 37 лет). Суспензию мононуклеаров получали центрифугированием в градиенте плотности фи-колл-верографина (1.077 г/см3). Далее методом иммуномагнитной сепарации (Dynabeads Untouched Human CD4 Т Cells; "Invitrogen", Норвегия) из суспензии МПК выделяли CD4+T-лим-фоциты. Выделенные клетки (5 • 106/мл) инкубировали в полной питательной среде (RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 200 ед/мл гентамицина) с гормоном в течение 72 ч при 37°C в условиях 5% СО2. Кисспептин (Кисспептин-54, Metastin, Synthetic, "Calbiochem", США) использовали в физиологических концентрациях, соответствующих его уровню в периферической крови в I, II и III триместрах беременности, — 1.3, 4.6 и 9.6 пМ/л соответственно [4]. В контрольные пробы вместо гормона добавляли официнальный растворитель.

Для индукции формирования аЪ^ из CD4+T-лимфоцитов в культуры добавляли трансформирующий фактор роста P1 (TGF-P1) (5 нг/мл,

РОЛЬ КИССПЕПТИНА

495

Таблица 1. Влияние кисспептина на количество Treg/Th17 СВ4+Т-лимфоцитов периферической крови женщин in vitro (n = 6)

№ Экспериментальное воздействие CD4+FOXP3+ GITR+, % CD4+FOXP3+ CTLA4+, % CD4+ROR-yt+ IL17A+, %

1 Контроль 0.35 ± 0.061 0.33 ± 0.035 0.40 ± 0.030

2 Кисспептин, 1.3 пМ/л 0.57 ± 0.065 0.50 ± 0.050 0.27 ± 0.029

Р(2-1) < 0.05 Р(2-1) < 0.05 Р(2-1) < 0.05

3 Кисспептин, 4.6 пМ/л 0.80 ± 0.125 0.67 ± 0.085 0.26 ± 0.024

Р(3-1) < 0.05 Р(3-1) < 0.05 Р(3-1) < 0.05

4 Кисспептин, 9.6 пМ/л 0.78 ± 0.100 0.68 ± 0.112 0.25 ± 0.036

Р(4-1) < 0.05 Р(4-1) < 0.05 Р(4-1) < 0.05

"Gibco", США), магнитные частицы с нанесенными affrn-CD3/CD28 моноклональными антителами (Dynabeads Human T-activator CD3/CD28, "Invitrogen", Норвегия) и нейтрализующие анти-IFNy и анти-1Ь-4-моноклональные антитела (10 мкг/мл, "eBioscience", США) [8]. После 72 ч инкубации клеток с гормоном удаляли магнитные частицы и оценивали фенотип лимфоцитов методом проточной цитометрии на цитофлюори-метре ("Becton Dickinson", США). Жизнеспособность лимфоцитов в тесте с эозином составляла 95—98%. Окрашивание поверхностных и внутриклеточных маркеров осуществляли согласно методике производителя моноклональных антител ("eBioscience", США). Treg определяли с использованием внутриклеточных моноклональных антител для FOXP3 (forkhead box P3) — основного маркера Treg и поверхностных моноклональных антител для CTLA-4 (цитотоксический Т-лимфоцитассоцииро-ванный антиген 4 (CD152)) и GITR (индуцируемый глюкокортикоидами TNF-рецептор), которые экспрессируются на функционально зрелых клетках с высокой супрессорной активностью [9], (CD4+FOXP3+CTLA-4 (anti-human Foxp3-PerCy-5.5; anti-human CD152-PE)) и CD4+FOXP3+GITR+ (anti-human Foxp3-PerCy-5.5; anti-human CD357-Alexa Fluor 488) гейте CD4+T-лимфоцитов соответственно. Одновременно в супернатантах данных культур клеток определяли уровень IL-10 им-муноферментным методом с использованием коммерческого набора ООО "Вектор Бест" (Россия) на многофункциональном гибридном фотометре Syn-erge H1 ("Bio-Tek Instrumens, Inc.", США).

Для индукции формирования Th17 из CD4+T-лимфоцитов в культуры МПК вносили IL- 1ß (10 нг/мл, "eBioscience") и IL-6 (10 нг/мл, "eBioscience"), инициирующих экспрессию сиротского рецептора у ретиноидов (RORyt) с последующей продукцией IL-17A [10]. Кроме этого добавляли магнитные частицы с нанесенными анти-CD3/CD28-моноклональными антителами, нейтрализующими интерферон у (анти-IFNy) и IL-4 (анти-^-4-моноклональные антитела). Продукцию Th17 оценивали как процент CD4+T-лимфо-

цитов, экспрессирующих RORyt и IL-17A (antihuman RORyt-PE; anti-human IL-17A-PerCP-Cy5.5). Одновременно в супернатантах данных культур оценивали уровень IL-17A иммунофер-ментным методом с использованием коммерческого набора ООО "Вектор Бест".

Активность IDO в МПК определяли спектро-фотометрически по изменению концентрации кинуренина — первого стабильного метаболита IDO-реакции [11]. Для этого использовали стандартный индуктор — липополисахарид (ЛПС) в концентрации 100 нг/мл ("Sigma", США) [12]. МПК, стимулированные ЛПС, культивировали в растворе Хенкса, содержащем 100 мкМ триптофана ("Sigma", США), в течение 4 ч. Затем к 100 мкл клеточного супернатанта добавляли 50 мкл 30%-й трихлоруксусной кислоты, встряхивали и центрифугировали в течение 5 мин, после чего в лунки 96-луночного планшета вносили 75 мкл супернатанта, смешивали с равным объемом реактива Эрлиха. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на многоканальном спектрофотометре Biohit BP 800 ("Bio-Tek Instrumens, Inc.", США).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью парного i-критерия Стьюдента.

Установлено, что кисспептин в концентрациях, характерных для I—III триместров беременности, усиливает формирование функционально активных ат-eg (CD4+FOXP3+CTLA-4+GITR+) из TGF-ß1-примированных CD4+Т-лимфоцитов. Одновременно гормон, вне зависимости от концентрации, достоверно угнетает процессы дифференцировки Th17 клеток (RORyt+IL-17A+) из IL-^/IL-6-при-мированных CD4+Т-лимфоцитов периферической крови (табл. 1).

Оценка уровней IL-10 и IL-17A в супернатантах фракционированных CD4+Т-лимфоцитов показала, что кисспептин статистически значимо усиливает продукцию IL-10 в культурах клеток, где индуцировались aTreg, и угнетает секрецию IL-17A в культурах клеток, где индуцировались Th17 лимфоциты (табл. 2).

49б

ГОРБУНОВА, ШИРШЕВ

Таблица 2. Влияние кисспептина на продукцию 1Ь-10 и 1Ь-17Л СБ4+Т-лимфоцитами периферической крови женщин (п = 6)

№ Экспериментальное воздействие IL-10, пг/мл IL-17A, пг/мл

1 ^нтроль 847.3 ± 32.04 23б.8 ± 1б.90

2 Kисспептин, 11б1.8 ± 109.13 17б.2 ± 9.89

1.3 пM/л P(2-l) < 0.05 P(2-l) < 0.05

3 Kисспептин, 1041.5 ± 82.б8 190.0 ± 5.72

4.б пM/л P(3-l) < 0.05 P(3-l) < 0.05

4 Kисспептин, 1000.5 ± 52.92 192.7 ± 4.73

9.б пM/л P(4-l) < 0.05 P(4-l) < 0.05

При оценке ЛПС-индуцируемой активности IDO в МПК установлено, что кисспептин достоверно усиливает активность фермента только в концентрации, соответствующей II триместру беременности (рис. 1). Учитывая, что IDO продуцируется только APC, которые в МПК представлены моноцитами, можно предполагать, что кисспептин усиливает ЛПС-стимулирующий сигналинг, приводящий к экспрессии активного IDO в данных клетках.

Таким образом, на протяжении всей беременности кисспептин способствует формированию иммунологической толерантности к антигенам фетоплацентарной единицы. Гормон усиливает генерацию активных aTreg, экспрессирующих молекулы CTLA-4 и GITR, одновременно повышая

*#

Кинуренин, мкМ 9

8

7

6

5

4 3 2 1 0

1 2 3 4 5

Группы исследования

Рис. 1. Влияние кисспептина на модуляцию активности IDO.

* — достоверные (р < 0.05) различия по сравнению с контролем; # — достоверные (р < 0.05) различия с группой 2. По оси ординат — концентрация кинуре-нина, по оси абсцисс — группы исследования: 1 — контроль; 2 — ЛПС 100 нг/мл; 3 — кисспептин 1.3 пМ/л + ЛПС; 4 — кисспептин 4.6 пМ/л + ЛПС;

5 — кисспептин 9.6 пМ/л + ЛПС.

секрецию IL-10, частично опосредующего дистантный механизм иммуносупрессорной активности Treg клеток [9]. Известно, что развитие ге-стозов и спонтанных абортов сопровождаются достоверным снижением уровня и функциональной активности Treg, в частнос

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком