БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 2, с. 314-321
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК577.352.462; 57.017.642; 57.086.864
РОЛЬ КЛЕТОК ТРОФОБЛАСТА В PЕГУЛЯЦИИ ВЫЖИВАЕМОСТИ БЛАСТОЦИСТ МЫШИ in vitro ПОСЛЕ МИКРОИНЪЕКЦИИ
И ОСМОТИЧЕСКОГО ШОКА
© 2014 г. Е.А. Храмцова, Л.М. Межевикина, Е.Е. Фесенко
Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области, ул. Институтская, 3
E-mail: hramelan@gmail.com Поступила в p едакцию 18.07.13 г.
П редставлена оценка состояния предимплантационных зародышей мыши на стадиях морулы -поздней бластоцисты - после микроинъекции культуральной среды Виттена и осмотического стресса в условиях физиологического р а створа (310 мОсМ), 5% глюкозы (560 мОсМ) и повышенной концентрации NaCl (614 мОсМ). Показано, что микроинъекции и осмотический стресс вызывают схожие изменения морфологии зародышей: сокращение объема с последующим его восстановлением в культуральных средах, осмотичность которых ниже физиологического значения (260 мОсМ). Способность зародышей восстанавливать свой объем и морфологию до исходного уровня зависит от стадии зрелости слоя клеток трофобласта. Выявлена их ключевая роль в регулировании объемного гомеостаза зародышей после микроинъекций и кратковременного осмотического стресса (30-60 мин). Оба физических воздействия стимулируют последующее развитие зародышей in vitro до стадии образования первичных колоний эмбриональных клеток и трофобласта. Эти данные могут быть использованы для разработки морфологических критериев имплантационного потенциала зародышей на стадии бластоцисты.
Ключевые слова: стадии бластоцисты, клетки трофобласта, микроинъекция, осмотический шок.
Раннее предимплантационное развитие зародышей у разных видов млекопитающих завершается стадией бластоцисты, на которой формируется функциональный слой полярных клеток трофобласта (ТБ), участвующих в про -цессе формирования внутренней полости - бла-стоцеля, заполненной жидкостью. П редшествен-ники клеток трофобласта появляются на 8-кле-точной стадии [1,2] и характеризуются тем, что они контролируют ионный градиент, перенос воды в полость и межклеточные взаимодействия [3-5]. На стадии бластоцисты ТБ защищает клетки внутренней клеточной массы от внешних воздействий, принимает участие в процессах имплантации.
Полярность клеток ТБ обусловлена особенностями строения и функционирования плазматических мембран, поддерживающих градиент ионов К+, К+ и С1- за счет работы Ка+/К+-АТФаз, локализованных на базолатеральной, обращенной к полости, поверхности мембраны и активности хлорных каналов, участвующих в напр авленном перено се ионов С1- внутрь полости [3,6-8]. Жидкость в межклеточное про -
Сокращения: ТБ - трофобласт, М СВ - модифицированная среда Виттена, KSOM - среда, оптимизированная по ионам калия.
странство закачивается по ионному градиенту через специальные белки - аквапорины [3,4]. П ри этом следует иметь в виду, что формиро -вание стадии бластоцист in vitro происходит в средах, осмолярность которых колеблется в пределах 260-280 мОсМ, что ниже физиологического значения [9]. Биологический смысл про -цесса образования бластоцеля сводится к увеличению объема зародыша за счет поступления большого количества жидкости вовнутрь, что создает избыточное давление на стенки блестящей оболочки (zona реИиаёа), способствует ее разрыву и выходу бластоцисты из z. реИис1ёа.
Нарушение процесса образования стадии бластоцисты наблюдается при осмотическом шоке. Так, при физиологических значениях о с-молярности среды наблюдается блок развития на стадиях 2-, 4- и 8-клеточного зародыша [9]. На этих стадиях не сформирован функциональный слой полярных клеток ТБ и зародыши не способны самостоятельно поддерживать ионный транспорт и собственный объем [10]. В условиях повышенной осмотичности среды только полярные клетки ТБ обеспечивают объемный гомеостаз зародыша за счет синтеза транспортеров низкомолекулярных органических веществ, таких как глицин, бетаин, глю-тамин, в-аланин, выступающих в качестве ос-
Рис. 1. Стадии развития предимплантационных зародышей мыши: (а) - морула; (б) - компактная морула; (в) -ранняя бластоциста; (г) - средняя бластоциста; (д) - поздняя бластоциста; (е) - поздняя бластоциста после микроинъекции. Dmax - максимальный диаметр и Dmin - минимальный диаметр зародыша для изменения его объема. БО - блестящая оболочка (zona pellucida); ВКМ - клетки внутренней клеточной массы; З - зародыш на стадии компактной морулы; ТБ - клетки трофобласта; ПБ - полость бластоцисты (бластоцель); ПП -перивителлиновое пространство. Шкала - 50 мкм.
мопротекторов [10-14]. Добавление этих веществ в культур альную ср еду способствует поддержанию объема зародышей в гиперосмотических условиях, что позволяет им развиваться до стадии бластоцисты [15].
П роцедура микроинъекции, широко используемая для создания экспер иментальных моделей [16], позволяет вносить в полость бласто-цисты дополнительный генетический материал (растворы ДНК и/или целые клетки) в относительно большом объеме жидкости. Это может приводить к осмотическому и механическому стрессу, нарушению транспорта жидкости сквозь слой клеток трофобласта, от активности которых зависит степень «зрело сти» зародыша и его готовность к имплантации [17]. Мы предположили, что устойчивость предимплантаци-онных зародышей к осмотическому стрессу и их последующая выживаемость в культуре in vitro будут зависеть от активности клеток тро-фобласта, регулирующих транспорт жидкости и межклеточные взаимодействия на предим-плантационных стадиях р азвития. В данной ра -боте представлен комплексный подход для оценки роли трофобласта в регуляции транспорта жидкости на разных стадиях предимплан-тационного развития: морулы, компактные мо-
рулы и бластоцисты после микр оинъекции и в условиях осмотического шока.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования. Для работы использовали стоки мышей NMRI из питомника Научного центра биомедицинских технологий РАМН (Светлые горы, Московская обл.). Эксперименты на животных проводили в соответствии с требованиями Федерации Европейских научных ассоциаций по содержанию и использованию лабораторных животных в научных исследованиях (Federation of Еигореаи Laboratory Animal Баепсе Assotiation). У самок в возрасте 8-10 недель стимулировали овуляцию подкожным введением по 5 ед/мышь фолликулостиму-лирующего гормона (Фоллимаг, Мосагроген) и хорионического гонадотропина человека (Московский эндокринный завод) с интервалом в 5254 ч. После инъекции хорионического гонадотропина человека самок подсаживали на ночь к самцам из расчета 3:1 для спаривания. Утром на следующий день отбирали самок с копуля-тивными пробками. День обнаружения пробки считали первым днем беременности. Зародышей на стадиях морулы - бластоцисты (рис. 1) -
вымывали из рогов матки на 3,5 и 4,5 дни беременно сти. Бластоцисты делили на р анние, средине и поздние в зависимости от степени развития слоя ТБ и объема полости. Оценку морфологии бластоцист пр оводили под инвертированным микроскопом IX-70 с объективом по Хоффману (01ушр^, Япония). Для выделения зародышей использовали ср еду M2 на о с-нове фосфатного буфер а (Sigma, США).
Культивирование зародышей. Бластоцисты культивировали в модифицированной среде Виттена (МСВ) [18], морулы - в оптимизиро-ванной по ионам калия среде (KS0M) [19]. Культивир ование проводили в 4-луночных эмбриологических чашках Петри (Nun^ Дания) в атмосфере с 5% СО2 (Sanyo, Япония). Длительность культивирования составляла 24-72 ч в зависимости от стадии развития. Выживаемость зародышей оценивали по морфологии, способности развиваться до стадии поздней бластоцисты, выходить из z. ре11иаёа и формировать in vitro первичные колонии из клеток трофобласта и внутр енней клеточной массы.
Осмотический шок. И спользовали растворы NaCl в концентрациях 154, 277 и 307 мМ, что соответствует следующим измер енным значениям осмолярности - 310, 560 и 614 мОсМ. Отдельно готовили 5% раствор глюкозы на основе физиологического раствора, что соответствовало значению осмолярности 560 мОсМ. Осмотическое давление ра створ ов измер яли с помощью осмометра VAPR0 5520 (Wesror, США). Различия в расчетных и измеренных значениях осмоляр ности не превышали 20 мОсМ. Д робя-щиеся зародыши на стадии морулы (рис. 1а) помещали на 30 и 60 мин в физиологические условия (310 мОсМ), компактные морулы и бластоцисты (рис. 1б-д) помещали на 30 мин в условия 560 (5%-глюкозы в физиологическом ра створе) и 614 мОсМ. Каждые 10 мин измер яли объем зародышей, после чего их переносили в ср еды для культивирования М СВ и К SOM (260 мОсМ). Выживаемо сть морул-бластоцист после осмотического шока оценивали по способности восстанавливать объем и после перено са в культур альные среды развиваться in vitro. В развившихся бластоцистах пересчитывали количество клеток ТБ.
Объем зародышей. Для расчета внутреннего объема зародышей (без учета z. реИиаёа) измеряли два взаимно перпендикулярных диаметра: максимальный (D шах) и минимальный (Dmin) (рис. 1г). Объем зародышей рассчитывали по формуле: V = п/8 х D;^ х Dmin. Измерения проводили с помощью программы анализа изображений ImageJ до и после процедуры микроинъекции.
Микроинъекция в полость бластоцисты. Для
микроинъекции использовали средние и поздние бластоцисты, интактная группа включала 24 зародыша. В полость бластоцисты вводили модифицир ованную среду Виттена в фиксиро -ванных объемах: 30, 40 и 50 нл. Микроинъекцию проводили с помощью микроманипулятора TransferMan (Еррепёог^ Германия).
Статистическая обработка. Cтатистическую обработку данных проводили с помощью про -граммного обеспечения SigmaPlot 11.0. Данные по объему бластоцист соответствовали нормальному распределению согласно критерию Шапир о-Уилка (P = 0,945). Для ср авнения средних значений использовали двухфактор ный дисперсионный анализ (тест X олм-Сидака). Цифровые данные представлены в виде относительных величин, их средних и указания стандартной ошибки ср еднего (SE). Динамику развития зародышей по стадиям оценивали с помощью метода х2.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Микроинъекция. Было показано, что после микроинъекции в полость бластоцисты среды Виттена (3
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.