научная статья по теме РОЛЬ N-ГЛИКАНОВ ГЛИКОПРОТЕИНА Е1 ВИРУСА ГЕПАТИТА С В ПРОЦЕССЕ СБОРКИ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСА И ФОРМИРОВАНИИ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ Биология

Текст научной статьи на тему «РОЛЬ N-ГЛИКАНОВ ГЛИКОПРОТЕИНА Е1 ВИРУСА ГЕПАТИТА С В ПРОЦЕССЕ СБОРКИ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСА И ФОРМИРОВАНИИ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 577.21;578.821

РОЛЬ ^ШИКАНОВ ГЛИКОПРОТЕИНА Е1 ВИРУСА ГЕПАТИТА С В ПРОЦЕССЕ СБОРКИ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСА И ФОРМИРОВАНИИ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ

© 2013 г. О. В. Орлова1, В. Л. Друца2, П. В. Спирин1, В. И. Попенко1, В. С. Прасолов1, П. М. Рубцов1, С. Н. Кочетков1, С. Н. Белжеларская1*

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 2Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119899

Поступила в редакцию 15.05.2012 г. Принята к печати 21.06.2012 г.

Оболочечные белки Е1 и Е2 вируса гепатита С (ВГС) играют ключевую роль в его жизненном цикле. Являясь основными компонентами вириона вируса, они участвуют в формировании инфекционных частиц. Вирусные белки оболочки содержат К-гликаны, которые могут непосредственно воздействовать на сворачивание белков, на образование функционального гликопротеинового комплекса, связывание вируса с клеткой и на другие функции этих белков. Влияние К-гликанов гликопротеина Е1 ВГС на процесс сборки структурных белков анализировали с помощью сайт-направленного мутагенеза в модельной системе — клетках насекомых 819, синтезирующих три вирусных структурных белка с образованием вирусоподобных частиц с участием бакуловирусной системы экспрессии. Удаление единичных сайтов гликозилирования гликопротеина Е1 не сказывается на эффективности его синтеза в клетках насекомых, а электрофоретическая подвижность му-тантных белков Е1 возрастает пропорционально снижению числа сайтов гликозилирования. Повреждение сайтов гликозилирования N1 или N5 гликопротеина Е1 влияет на образование нековалентного гетеродимера Е1Е2 — прототипа природного комплекса, входящего в состав вириона ВГС. Показано также, что отсутствие углеводных цепей в сайтах N1 и N5 Е1 существенно уменьшает эффективность его синтеза в клетках млекопитающих НЕК293Т.

Ключевые слова: вирус гепатита С (ВГС), белки оболочки Е1 и Е2 ВГС, вирусоподобные частицы, ^гаико-зилирование белков, олигонуклеотид-направленный мутагенез, бакуловирусная система экспрессии, клетки насекомых 819, клетки млекопитающих НЕК293Т.

ROLE OF N-LINKED GLYCANS IN HCV GLYCOPROTEIN E1 IN THE FOLDING OF STRUCTURAL PROTEINS AND FORMATION VIRAL PARTICLES, by O. V. Orlova1, V. L. Drutsa2, P. V. Spirin1, V. I. Popenko1, V. S. Prasolov1, P. M. Rubtsov1, S. N. Kochetkov1, S. N. Beljelarskaya1* (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia, *e-mail: belj@eimb.ru; 2Chemical Department, Moscow State University, Moscow, 119899 Russia). Envelope proteins of HCV play a major role in virus lifecycle. These proteins are main components of the virion. They are involved in virus assembly. Envelope proteins are modified by N-linked glycosylation which is supposed to play a role in their stability, in the assembly of the functional HCV glycoprotein heterodimer, protein folding and viral entry. The role of N-linked glycosylation sites in HCV E1 protein in structural proteins assembly was analyzed by site-directed mutagenesis in a model system — insect cells producing three viral structural proteins with formation of virus-like particles. Removing of single N-linked glycosylation sites in HCV E1 protein does not affect the efficiency of its expression in insect Sf9 cells. E1 electrophoretic mobility is increasing in parallel with decreasing the number of glycosylation sites. The destroying of glycosylation sites N1 or N5 in E1 influences the assembly of noncovalent glycoprotein heterodimer E1E2 — the prototype of natural complex incorporated in virion.The lack of glycans in N1 and N5 sites of E1 was shown to affect the efficiency of its expression in mammalian HEK293 T cells.

Keywords: hepatitis C virus (HCV), HCV structural proteins, virus-like particles, site-directed mutagenesis, recombinant baculovirus, insect Sf9 cell, mammalian cells HEK293T, HCV glycoprotein glycosylation.

DOI: 10.7868/S0026898413010126

Принятые сокращения: ВГС — вирус гепатита С; ВПЧ — вирусоподобные частицы; ЭР — эндоплазматический ретикулум; БОЕ — бляшкообразующие единицы.

* Эл.почта: belj@eimb.ru

147

10*

Многие белки эукариотических клеток подвергаются посттрансляционному процессингу. Один из наиболее распространенных типов посттрансляционной модификации белка — это N-гликозилирование, при котором малоразветвлен-ная олигосахаридная цепочка, состоящая из девяти остатков маннозы (Man) и трех остатков глюкозы (Glc), присоединяется к специфическим остаткам аспарагина в последовательности Asn-X-Ser или Asn-X-Thr (где X — любая аминокислота, кроме пролина) [1]. Присоединение олигоса-харида к белку сопряжено с его фолдингом, при котором гликопротеин входит в кальнексин-кальретикулиновый цикл, специфически взаимодействуя с лектиноподобными шаперонами эндоплазматического ретикулума (ЭР) клетки, которые обеспечивают его частичное сворачивание. Наличие N-олигосахаридов (N-гликанов) может стабилизировать структуру белка, влиять на специфичность белок-белковых взаимодействий [2—9], а также играет важную роль в сворачивании большинства связанных с мембраной и секретируемых гликопротеинов. Гликозилирова-ние есть характерный тип модификации поверхностных белков оболочечных вирусов.

Вирус гепатита С (ВГС) — единственный представитель рода Hepacivirus — относится к семейству Flaviviridae. Его геном кодирует один полипротеин-предшественник длиной примерно 3000 а.о., который подвергается процессингу в ЭР с образованием десяти зрелых структурных и неструктурных белков вируса [10—13]. Детальное строение вирусной частицы ВГС и способ ее формирования остаются мало изученными [12], причем наименее изучен процесс сборки вирионов и их выход из клетки. Обоснованно предполагается, что свойства вириона зависят от гликозилирования оболочечных белков ВГС в зараженной клетке, их взаимодействия и характера укладки [14, 15].

Гликопротеины оболочки вириона Е1 и Е2 содержат 5—6 и 9—10 потенциальных сайтов глико-зилирования соответственно [11]. Следует отметить, что до сих пор не известно ни точное число сайтов гликозилирования Е1, ни то, какие именно сайты участвуют в модифицировании белка и все ли эти потенциальные сайты "работают" in vivo.

После гликозилирования гликопротеины E1 и E2 ВГС могут либо димеризоваться, с образованием функциональных нековалентных комплексов, либо образовывать дисульфидные мостики и формировать агрегаты, содержащие неправильно свернутые нефункциональные белки. В образовании комплексов участвуют два клеточных белка-шаперона — кальнексин и кальретикулин. Первый взаимодействует с гликопротеинами, участвующими в образовании функциональных комплексов, а кальретикулин — с неправильно упакованными гликопротеинами, образующими агрегаты

[14—16]. Комплексы первого типа обеспечивают связывание вируса с рецепторами клетки и проникновение вирусной частицы в клетку, влияют на формирование его антигенного состава и, возможно, играют определенную роль в вирусном патогенезе [17]. Образование агрегатов неправильно свернутых гликопротеинов может приводить к образованию дефектных вирусных частиц, способных, возможно, подавлять способность вируса связываться с клеткой и нарушать выход вируса из клетки [18—20].

Мы исследовали влияние М-гликанов глико-протеина Е1 ВГС на процесс сборки структурных белков и формирование вирусных частиц с помощью сайт-направленного мутагенеза в модельной системе, в которой вирусоподобные частицы (ВПЧ), морфологически подобные природному вириону, формируются в клетках насекомых, трансфицированных бакуловирусными векторами; эти векторы направляют экспрессию генов структурных белков ВГС [15]. Для создания мутантов Е1 применена схема олигонуклеотид-на-правленного мутагенеза с использованием "стандартных" двутяжевых плазмидных векторов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Бактериальные клетки, клеточные культуры и плазмиды. Использовали штаммы Escherichia coli DH5a и DH10Bac ("Gibco-BRL", США), линию клеток Sf9 Spodoptera frugiperda и эмбриональные клетки почки человека линии HEK293T.

Бактериальные клетки трансформировали плаз-

мидными ДНК согласно рекомендациям фирмы-изготовителя ("Amersham", США). Выделение и очистку плазмид, расщепление рестриктазами, лигирование, электрофорез ДНК в агарозном геле и другие генно-инженерные манипуляции проводили по стандартным протоколам [21].

Клетки насекомых культивировали в среде Sf-900 II, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, при 27°С, используя основные технические приемы, разработанные ранее и описанные в инструкции [22]. Для определения титра вируса, амплификации рекомбинантного вируса, заражения клеток Sf9 рекомбинантным бакуловирусом, а также для анализа вирусной экспрессии использовали ту же инструкцию.

Эмбриональные клетки почки человека линии HEK293T культивировали в стандартной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 4 мМ L-глутамин, 1 мМ пируват натрия, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед/мл соответственно, при температуре 37°С и атмосфере 5% CO2.

РОЛЬ N-ГЛИЕАНОВ ГЛИKOПPOTEИHA Ei ВИРУСА геПАТИТА С

149

Использованные праймеры

Праймер Нуклеотидная последовательность 5'-3'

16-Haml CCA CTA CGA CAA TAC G

15-Hamr GAG CAA GTC GAC GTG

26-N5tl GGA CTG CCA ATG CTC AAT CTA TCC CG

17-N6tl TGG TCA CTT ACA ACA GC

23-N5br GAG CAT TGG CAG TCC TGC ACT GT

17-N6br CTG TTG TAA GTG ACC AG

17-N7tl GAA CTG GTC TAA GGT TC

17-N7br AAC CTT AGA AGA CCA GTT CC

24r-Hpsr AG CTG CAG TTA CCC GTC AAC GCC

29-EN1m TTA TGA AGT GCG CCA AGT GTC CGG CAT AT

30-EN2m AAC GAC TGC TCC CAA TCA AGC ATT GCG TAT

27-EN3m GTT CAG GAG GGT CAA AGC TCC CGT TGC

24-EN4m CGC GGC CAG GCA AGC CAG CGT CCC

19 Haml CAC TAC GAC AAT ACG ACG T

18 Hamr AGC AAG TCG ACG TGA CGT

Рекомбинантные конструкции, несущие кДНК, соответствующие генам структурных белков ВГС, рекомбинантные бакмиды, а также рекомбинант-ный бакуловирус bv-CE1E2 получали и анализировали по ранее отработанным методикам [23].

Сайт-направленный мутагенез. Фрагмент ДНК, содержащий последо

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»