НЕЙРОХИМИЯ, 2009, том 26, № 4, с. 318-327
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.175.82, 577.175.328, 611.814
РОЛЬ НОРАДРЕНАЛИНА В РАЗВИТИИ ДОФАМИН-ЗАВИСИМОЙ ГИПЕРПРОЛАКТИНЕМИИ
© 2009 г. Л. К. Дильмухаметова1, Т. С. Пронина1, 2 *, Г. 3. Зиязетдинова1, 2,
В. С. Кудрин2, М. В. Угршмов1, 2
Лаборатория гормональных регуляций, Учреждение Российской академии наук, Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 2Лаборатория нейрогистологии им. Б.И. Лаврентьева, Государственное учреждение Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П К. Анохина РАМН
Гиперпролактинемия - нейродегенеративное заболевание, развивающееся у человека в результате дегенерации дофаминергических (ДА-ергических) нейронов аркуатного ядра, синтезирующих ДА -нейрогормон, ингибирующий секрецию пролактина лактотрофами гипофиза. Понимание причин и механизмов развития гиперпролактинемии, разработка ранней диагностики и лечения этого заболевания возможны только при создании и тщательном анализе адекватных экспериментальных моделей. Гиперпролактинемию обычно моделируют в эксперименте с помощью 6-гидроксидофамина (6-ГДА) -нейротоксина, вызывающего дегенерацию ДА-ергических нейронов аркуатного ядра. При этом не учитывается то, что 6-ГДА также вызывает дегенерацию норадренергических (НА-ергических) аксонов, участвующих в регуляции секреции пролактина. Поэтому целью данной работы явилась оценка роли НА в развитии гиперпролактинемии при дегенерации ДА-ергических нейронов аркуатного ядра. Для этого проведен сравнительный анализ изменения метаболизма ДА и НА в аркуатном ядре, а также уровня пролактина в крови у крыс при действии только 6-ГДА и при действии 6-ГДА на фоне действия десметилимипрамина, предохраняющего НА-ергические нейроны от дегенерации. Исследование проводили сначала через 14 дней после введения токсина, т.е. в то время, когда должны закончиться дегенеративные процессы в ответ на введение токсина, а затем через 45 дней, в то время, когда включены компенсаторные процессы. Показано, что через 14 дней после введения фармакологических агентов гиперпролактинемия, вызванная дегенерацией ДА-ергических нейронов аркуатного ядра и возникающем при этом дефицитом ДА, усиливается при сохранении НА-ергических афферентов, что можно объяснить ингибирующим влиянием НА на синтез ДА. Это предположение подтверждается тем, что через 45 дней после введения только 6-ГДА, т.е. при сочетанной дегенерации ДА-ергических нейронов и НА-ергических аксонов, происходит компенсаторное увеличение синтеза ДА в аркуатном ядре до нормы, что сопровождается возвращением к норме и уровня пролактина в крови. Напротив, через 45 дней после введения 6-ГДА и десметилимипрамина происходит увеличение синтеза НА до нормы, а синтез ДА в аркуатном ядре продолжает оставаться на низком уровне, что сопровождается сохранением повышенного уровня пролактина в крови. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что НА оказывает ингибирующее влияние на синтез ДА в аркуатном ядре, препятствуя компенсаторному увеличению синтеза ДА и нормализации уровня пролактина в крови при дегенерации ДА-ергических нейронов.
Ключевые слова: мозг, гипоталамус, нейрон, гипофиз, дофамин, норадреналин, пролактин, 6-гид-роксидофамин, десметилимипрамин, высокоэффективная жидкостная хроматография, иммуно-ферментный анализ.
ВВЕДЕНИЕ
Пролактин - полипептидный гормон, синтезирующийся лактотрофами передней доли гипофиза, играет важную роль в регуляции репродуктивной функции организма [1]. Секреция пролактина находится под ингибиторным контролем дофамина (ДА), синтезирующегося нейронами аркуатного ядра [2], и норадреналина (НА), синтезирующегося нейронами ствола мозга [3-5]. ДА выделяется из ак-
* Адресат для корреспонденции: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26; тел./факс: (499)135-88-42; e-mail: tatiana.pronina@mail.ru
сонов в срединном возвышении гипоталамуса в ги-пофизарную портальную систему циркуляции, достигает с портальным кровотоком передней доли гипофиза, оказывая ингибирующее влияние на секрецию пролактина через Д2 рецепторы на лакто-трофах [6]. Представления о характере и механизмах влияния НА на секрецию пролактина лактотрофами носят противоречивый характер. Так, по данным in vitro НА ингибирует секрецию пролактина через аь а2 и Р-адренорецепторы на лактотро-фах, а по данным in vivo - только через ^-адреноре-цепторы [5]. НА помимо прямого ингибирующего
влияния на лактотрофы оказывает непрямое стимулирующее влияние на выделение пролактина опосредованно через нейроны аркуатного ядра [4, 7].
Спонтанная прогрессирующая дегенерация ДА-ергических нейронов у человека приводит к усилению секреции пролактина и развитию так называемого синдрома гиперпролактинемии, а, в конечном счете, к нарушению репродуктивной функции, причем в относительно молодом возрасте [8]. Глубокое понимание причин и механизмов развития гиперпролактинемии, разработка ранней диагностики и лечения этого заболевания возможны только при создании адекватных экспериментальных моделей и их тщательного анализа. Для моделирования гиперпролактинемии традиционно используется 6-гидроксидофамин (6-ГДА) - нейро-токсин, вызывающий дегенерацию ДА-ергических нейронов аркуатного ядра. Возникающая при этом гиперпролактинемия компенсируется у крыс через 37-45 дней [9, 10]. При анализе механизмов развития гиперпролактинемии на этой модели не учитывался тот факт, что 6-ГДА помимо ДА-ергических нейронов вызывает дегенерацию и НА-ергических нейронов. Другими словами, при анализе модели гиперпролактинемии авторы исходят из представления о дегенерации ДА-ергических нейронов аркуатного ядра и возникающего при этом дефицита ДА, в то время как остается открытым вопрос о возможной дегенерации НА-ергических афферентов в аркуатном ядре и в срединном возвышении и ее вкладе в развитие гиперопролактинемии [10, 11]. Поэтому цель данной работы - оценка роли НА в развитии гиперпролактинемии при дегенерации ДА-ергических нейронов. Для этого проведен сравнительный анализ изменения метаболизма ДА в ме-диобазальном гипоталамусе и уровня пролактина в крови у крыс при действии только 6-ГДА и при действии 6-ГДА на фоне действия десметилимипрами-на (ДМИ), предохраняющего НА-ергические нейроны от дегенерации [12].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные, опыты. Работу проводили на самцах крыс линии Вистар весом 220-240 г. Десяти животным внутрибрюшинно вводили 25 мг/кг веса ДМИ (Сигма, США) в 0.5 мл 0.9% NaCl (1-я группа) и десяти животным в контроле - 0.5 мл 0.9% NaCl (2-я группа). Через 40 мин животным стереотакси-чески в боковые желудочки мозга (координаты от брегмы: каудально - 0.8 мм, латерально - 1.5 мм, 3.2 мм от поверхности мозга) вводили в первой группе по 250 мкг 6-ГДА (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, США) в 15 мкл 0.9% NaCl с 0.1% аскорбиновой кислотой, а во второй - по 15 мкл 0.9% NaCl с 0.1% аскорбиновой кислотой, в обоих случа-
ях со скоростью 3 мкл/мин. Кроме того, десяти ин-тактным животным в боковые желудочки мозга вводили по 250 мкг 6-ГДА в 15 мкл 0.9% NaCl с 0.1% аскорбиновой кислотой (3-я группа), а десяти животным в контроле - по 15 мкл 0.9% NaCl с 0.1% аскорбиновой кислотой (4-я группа), в обоих случаях со скоростью 3 мкл/мин.
Взятие и обработка материала. Материал брали от пяти животных из каждой группы на 14-й день после инъекций и от такого же количества животных из каждой группы на 45-й день после инъекций. У крыс под наркозом пентобарбиталом натрия собирали кровь из левого желудочка сердца гепари-низированной пипеткой, через 40 мин после хранения при 4°C кровь центрифугировали в течение 30 мин при 4°C со скоростью 3000 об/мин, собирали супернатант и замораживали его в жидком азоте. После забора крови животных декапитировали и выделяли мозг. Затем из мозга под контролем бинокулярной лупы на холоду выделяли стриатум, черную субстанцию, срединное возвышение и арку-атное ядро (рис. 1). Ткань взвешивали и замораживали в жидком азоте. Сыворотку и ткань хранили при -70°C до биохимического анализа.
Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией. Концентрацию и содержание катехоламинов и их метаболитов определяли на 14-й и 45-й дни после инъекций в стриатуме, черной субстанции, срединном возвышении и в аркуатном ядре методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией. Ткань каждой пробы гомогенизировали с помощью ультразвукового гомогенизатора в 200 мкл 0.02 Н HClO4 с 1 нг 3,4-дигидроксибензил-амина в качестве внутреннего стандарта. Затем 40 мин центрифугировали при 15000 об/мин при 4°C и собирали супернатант.
Определение моноаминов проводили на обра-щенно-фазовой колонке (RP-18; OD-5 A; 250 X 4.6 мм; 5 мкм) (Brownee Labs, США). Подвижной фазой служил 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, содержащий 0.25 мМ октансульфоната натрия, 0.1 М ЭДТА и 9% ацетонитрила (pH 3.6). Скорость потока подвижной фазы была 1.8 мл/мин при давлении 17 атм. Потенциал веществ выходящих из колонки определяли с помощью электрохимического детектора (+0.65 B, чувствительность детектора 2 нА). Регистрацию и обработку данных проводили с помощью программы Мультихром v.1.5 (Ampersand Ltd., США).
Иммуноферментный анализ. Концентрацию пролактина в сыворотке крови определяли на 14-й и 45-й дни конкурентным методом иммунофер-ментного анализа. После размораживания сыворотку центрифугировали 30 мин при 5000 об/мин при 4°C. Определение пролактина проводили с ис-
Рис. 1. Схема выделения стриатума (А, Б), аркуатного ядра (А, В), срединного возвышения (А, В) и черной субстанции (А, Г) для высокоэффективной жидкостной хроматографии: Ак, акведук; АЯ, аркуатное ядро; БЖ, боковой желудочек; ЗК, задняя комиссура; ОХ, оптическая хиазма; ОН, оптические нервы; ПК, передняя комиссура; СВ, срединное возвышение; СГ, стебель гипофиза; С, стриатум; 3, третий желудочек; ЧС, черная субстанция.
пользованием набора реагентов "Rat prolactin A05101" (SpiBio, США) для конкурентного метода с чувствительностью определения 0.2 нг/мл. Оптическую плотность проб определяли с помощью люми-нометра-фотометра LM 01A (Immunotech, Чехия) при длине волны 405 нм. Регистр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.