НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 2, с. 109-116
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.816.7
РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В РЕГУЛЯЦИИ СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА И ПРОЦЕССОВ ЭКЗО- И ЭНДОЦИТОЗА СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ В ДВИГАТЕЛЬНОМ НЕРВНОМ ОКОНЧАНИИ МЫШИ © 2013 г. О. В. Яковлева*, М. У. Шафигуллин, Г. Ф. Ситдикова
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Институт фундаментальной медицины и биологии,
кафедра физиологии человека и животных
В опытах на диафрагмальной мышце мыши с использованием электрофизиологических и флуоресцентных методов исследовали влияние донора оксида азота (NO) — З-нитрозо-М-ацетил-БЬ-пени-цилламина (SNAP) и блокатора NO-синтазы — №-нитро-Ь-аргинин метилового эфира (LNAME) на секрецию медиатора и процессы экзо- и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании. В условиях одиночной стимуляции SNAP снижал, а LNAME не вызывал изменения амплитуд токов концевой пластинки, при этом оба исследуемых препарата не влияли на спонтанную секрецию медиатора. В условиях высокочастотной стимуляции (20 Гц, 3 мин) при действии SNAP наблюдали усиление, а при добавлении LNAME — замедление депрессии амплитуд потенциалов концевой пластинки (ПКП) по сравнению с динамикой ПКП в контроле. В опытах с использованием флуоресцентного красителя FM 1-43 было показано, что донор NO приводил к снижению, а LNAME — к увеличению интенсивности свечения нервных терминалей, загруженных красителем при стимуляции нерва с частотой 20 Гц в течение 30 с относительно контроля. При этом выгрузка красителя из предварительно загруженных маркером нервных окончаний под действием SNAP происходила быстрее и замедлялась при действии LNAME по сравнению с контролем. На основании полученных данных можно предположить, что экзогенный и эндогенный NO в нервно-мышечном синапсе мыши вызывает депрессию секреции медиатора, что может быть связано с угнетением процесса рециклизации синаптических везикул за счет ослабления эндоцитоза и/или мобилизации везикул из рециклирующего пула к зонам экзоцитоза.
Ключевые слова: оксид азота, секреция медиатора, двигательное нервное окончание, FM1-43, процессы экзо- и эндоцитоза, синаптические везикулы.
Б01: 10.7868/81027813313020106
Оксид азота (II) (N0) — первый газообразный посредник, функции которого всестороннее исследованы в различных системах организма [1, 2]. В центральной нервной системе N0 может как стимулировать, так и ингибировать секрецию медиатора [2—4], участвовать в регуляции синапти-ческой пластичности, включая долговременную потенциацию и депрессию, действуя в качестве ретроградного мессенджера, синтезирующегося в постсинаптическом нейроне и модулирующего функцию пресинаптических окончаний [2, 5, 6].
В периферической нервной системе N0 снижает спонтанную и вызванную секрецию ацетил-холина из двигательного нервного окончания лягушки [7—10], тогда как сведения о роли N0 в регуляции функции нервно-мышечного синапса теплокровных животных противоречивы. Имеются данные как об усилении, так и угнетении
*Адресат для корреспонденции: 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18, тел. (843) 233-78-44; e-mail: a-olay@yandex.ru.
освобождения медиатора из двигательных нервных окончаний крысы при действии доноров N0 и субстрата синтеза N0 — Ь-аргинина [11—15]. В нервно-мышечном соединении конститутивная нейрональная форма N0-синтазы ^-типа была показана в сарколемме мышечных клеток в области концевой пластинки [16], где ее локализация обеспечивается взаимодействием с дистрофино-вым гликопротеиновым комплексом [17]. Кроме того, нейрональная N0-синтаза также обнаружена в перисинаптических Шванновских клетках и двигательных нервных терминалях [18]. Механизмы действия N0 в нервной системе включают как изменение активности систем вторичных посредников, регуляции работы ионных каналов, так и непосредственное влияние на процессы транспорта и экзо-, эндоцитоза синаптических везикул [2, 19—21]. Процессы рециклирования синаптических везикул, включающие все этапы от экзоцитоза везикулы до приобретения ею повторной способности к экзоцитозу, являются
ключевыми в обеспечении секреции нейромеди-атора [22—24]. Изменение динамики этих процессов лежит в основе пресинаптических форм пластичности, а нарушения везикулярного цикла наблюдаются при многих психических и неврологических заболеваниях [24, 25]. Исследование механизмов действия NO в нервно-мышечном соединении актуально и в связи с участием этого посредника в патогенезе некоторых нервно-мышечных заболеваний, включая миастению гравис и мышечную дистрофию [26].
Цель нашей работы — исследование влияния NO на секрецию медиатора и процессы экзо- и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании мыши с использованием комплексного электрофизиологического и флуоресцентного подходов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы изолированные нервно-мышечные препараты m. diaphragm лабораторных белых мышей. Препарат помещали в камеру, перфузируемую оксигенированным раствором Кребса, содержащим (в мМ): NaCl — 137.0; KCl - 5.0; CaCl2 - 2.2; MgCl2 - 1.0; NaH2PO4 - 1.0; NaHCO3 - 16.0; глюкоза - 11.0; (t = 20°С, рН 7.27.4). Для блокирования сокращений мышечных волокон использовали d-тубокурарин (22.5 мкМ). В экспериментах использовали блока-тор NO-синтазы - NG-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (LNAME) в концентрации 100 мкМ и донор NO - S-нитрозо-N-ацетил-DL-пеницил-ламин (SNAP) в концентрации 100 мкМ (Sigma, США).
Регистрацию токов или потенциалов концевой пластинки (ТКП или ПКП соответственно) производили с помощью внеклеточного или внутриклеточного отведения с использованием стандартной микроэлектродной техники. Двигательный нерв стимулировали прямоугольными электрическими импульсами сверхпороговой амплитуды с частотами 0.2 Гц (одиночная стимуляция) или 20 Гц (высокочастотная стимуляция). Расчет квантового состава производили по методу анализа дисперсии амплитуд ПКП [27, 28]. Для усиления и регистрации ТКП и ПКП использовали автоматизированную систему, созданную на базе АЦП L-CARD 1250 и компьютера Pentium 4. Для анализа эффектов веществ на вызванные или спонтанные ответы регистрировали сигналы в контроле (в течение 10-15 мин), затем в перфузи-руемый раствор апплицировали исследуемое вещество в течение 30-40 мин, после чего производили отмывку стандартным раствором Кребса. В случае высокочастотной стимуляции SNAP или LNAME присутствовали в растворе в течение 2030 мин до начала раздражения.
Для исследования процессов эндо- и экзоци-тоза синаптических везикул использовали флуоресцентный маркер FM 1-43 (3 мкМ) (Biotium, США), который обратимо связывается с преси-наптической мембраной и во время эндоцитоза синаптических везикул оказывается внутри нервной терминали ("загрузка"). При этом наблюдается свечение нервного окончания, отражающее скопления синаптических везикул, захвативших краситель [27]. Для анализа процессов эндоцитоза синаптических везикул использовали следующий протокол "загрузки": нервно-мышечный препарат помещали в раствор, содержащий FM 1-43, и стимулировали с частотой 20 Гц в течение 30 с, после чего препарат отмывали от красителя раствором Кребса 40-45 мин и регистрировали свечение нервных терминалей. В каждом опыте производилась регистрация свечения 20-30 терминалей. Учитывая высокую скорость рециклирования си-наптических везикул в нервных окончаниях теплокровных животных [27], используемое время экспозиции красителя (30 с) позволило максимально снизить выгрузку загруженного красителя посредством экзоцитоза при продолжающемся раздражении.
Для анализа процессов экзоцитоза синаптиче-ские везикулы предварительно метили красителем (загружали краситель в нервное окончание). Для этого двигательный нерв раздражали в течение 3-х минут с частотой 20 Гц, а FM 1-43 присутствовал в растворе, как во время стимуляции, так и в течение 7 мин после ее окончания. После этого повторно стимулировали двигательный нерв с частотой 20 Гц в течение 30 мин, анализируя снижение интенсивности флуоресценции нервного окончания ("выгрузка" красителя).
Свечение нервных окончаний наблюдали с помощью микроскопа МИКМЕД-2 (ЛОМО, Санкт-Петербург) через водно-иммерсионные объективы LUMPLFL 60х/0.9^А (Olympus, USA). Все наблюдения проводили только на поверхностно-лежащих нервных окончаниях. Для регистрации картин флуоресценции использовали быстродействующую черно-белую видеокамеру AxioCam MRm (Carl Zeiss, Германия). Оценивали среднюю интенсивность свечения на участке нервной терминали длиной 10-20 мкм в относительных единицах (о.е.) - от 1 до 256. При анализе флуоресцентных изображений в случае "загрузки" красителя за фоновое значение принимали среднюю интенсивность свечения в участке изображения без нервного окончания размером 50 х 50 пикселей, в случае "выгрузки" красителя - свечение терминали после 30 мин стимуляции [27]. Предварительные эксперименты, в которых оценивали фоновое свечение мышечных волокон при добавлении красителя в контроле и вместе со SNAP или LNAME, позволили исключить взаимодействие исследуемых ве-
ществ с флуоресцентным маркером. Все данные обработаны методами вариационной статистики. Количественные результаты исследования представлены в форме — среднее значение ± стандартное отклонение, n — число независимых экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние донора NO — SNAP и блокатора NO-синтазы — LNAME на секрецию медиатора в условиях одиночной и высокочастотной стимуляции. В
условиях одиночной стимуляции нерва при внеклеточной регистрации ТКП добавление в пер-фузируемый раствор донора NO — SNAP приводило к достоверному уменьшению амплитуды ТКП до 81.9 ± 2.5% (n = 9, p < 0.05) по сравнению с контролем. Добавление блокатора NO-синтазы — L-NAME не вызывало достоверного изменения амплитуды ТКП (95.0 ± 7.3%) (n = 10, p > 0.05). Для регистрации миниатюрных ПКП (МПКП) использовали внутриклеточное отведение. Анализ амплитудно-временных параметров МПКП не выявил достоверных изменений как при аппликации SNAP, так и в условиях блокирования NO-синтазы. В контроле частота МПКП составила 1.00 ± 0.16 Гц (n = 8), амплитуда МПКП - 0.38 ± ± 0.07 мВ. К 30-й мин аппликации SNAP частота МПКП составила
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.